09 мая 2016г.
Иммобилизация ферментов на неподвижной матрице сегодня широко используется в науке и технологии для формирования высокочувствительных биологических сенсоров.
Основная проблема получения иммобилизованных ферментных препаратов заключается в том, что использование одного и того же метода в качестве стандартной процедуры приводит в случае различных ферментов к резким отличиям в их активности , стабильности, субстратной специфичности.
Кроме того, характеристики конечных иммобилизованных ферментных препаратов существенным образом зависят от способа выделения и очистки исходного образца фермента и природы носителя.
Для работы нами был использован препарат пероксидазы, выделенный из Элодеи канадской. В качестве подложки нами была использована матрица на основе аэросила А-175 (х.ч.) (ГОСТ 14922-77) и аэросила, модифицированного белком казеином (патент №2257951, Воробьева О.В., Кунижев С.М., Анисенко О.В., Фильм А.А., Бородина Т.Н., 2004). В качестве субстратов использовался пирокатехин и резорцин.
Иммобилизацию проводили методом физической адсорбции для чего к 0,6г матрицы приливали 1мл раствора пероксидазы с концентрацией 17,5 мг/мл. и удельной активностью 35,5 Е/мг. Инкубацию проводили при +4ºС в течение 24 часов.
Для удаления, не связавшегося белка, матрицу обрабатывали пятикратно дистиллированной водой объемом по 100 см3. Препарат иммобилизованной пероксидазы хранили в закрытой склянке при 4-6ºС. Удельную активность определяли фотоколориметрическим методом (патент №1262350, Стом Д.И., Забелина Т.В., Балаян А.Э., Саксонов М.Н., 1986)
Полученные данные по иммобилизации пероксидазы на различных носителях представлены в Табл.1.
Таблица 1
Сравнительная характеристика иммобилизованной пероксидазы на различных носителях
|
Носитель
|
Иммобилизация по белку
|
Удельная активность иммобилизованной пероксидазы Е/мг фермента
|
Удельная поверхность носителя, м2/г
|
Сохранение активности % (от свободного фермента)
|
|
мг/г сорбента
|
%
иммобилиза ции
|
|
Аэросил
|
20.3
|
58
|
23,40
|
175
|
60
|
|
Аэросил + казеин
|
14,7
|
42
|
28,2
|
240-
|
72
|
Согласно полученным данным с уменьшением удельной поверхности сорбента связывание белка увеличивается, что соизмеримо с размерами пор носителя и фермента. Т.к. пероксидаза является высокомолекулярным белком, то и сорбция ее должна увеличиваться на носителях с большим радиусом пор. Максимальная иммобилизация пероксидазы 58 % наблюдалась для сорбента на основе аэросила, меньшим процентом адсорбции фермента –42%- характеризуется аэросил, гетерогенезированный 3% по массе казеином.
Немаловажным параметром было определение максимальной “нагрузки”, т. е. максимального количества фермента, которое может быть иммобилизовано на определенном количестве носителя. Для этого нами использовались растворы фермента с концентрацией белка 4,5 мг/мл , 9,2 мг/ мл и 17,5 мг/ мл (Рисунок 2).
Анализ Рисунка 2 позволяет сделать вывод: что при увеличении нагрузки возрастает и степень сорбции фермента.
Однако увеличение нагрузки фермента на сорбент с 9, 2мг/ мл до 17, 5мг/ мл нецелесообразно, так как количество иммобилизованного фермента менялось незначительно, а потери его при отмывке составили 34% и 55% соответственно (Рисунок 2). При минимальной же нагрузке весь белок оказывался связанным, на что указывает отсутствие процесса десорбции
Таким образом, увеличение концентрации фермента при иммобилизации нецелесообразно в силу ограниченного числа адсорбционных центров на поверхности носителя и, как правило, значительных потерь фермента при последующей обработке препарата с целью удаления, не связавшегося белка.
Так как, процесс сорбции проводили физическими методами, то необходимо было также оценить и процессы десорбции фермента, для чего матрицы многократно обрабатывали бидистилированной водой (Рисунок 3).
Количество несвязавшегося фермента оценивали фотоколориметрически по содержанию белка в промывных водах и его ферментативной активности. При этом установлено, что полная десорбция несвязавшегося фермента наступает после однократной обработки матрицы на всех носителях.
Для свободной и иммобилизованной пероксидазы определена оптимальная концентрация субстрата. Максимальную удельную активность иммобилизованный фермент в отличие от свободного проявляет при - концентрации субстрата 4-5мМоль/л.
Подобная зависимость ферментативной активности от концентрации субстрата в растворе определяется двумя взаимосвязанными факторами: степенью ограничения диффузии субстрата и его концентрацией в растворе.
Затруднение диффузии субстрата сильно снижает его концентрацию в фазе фермента по сравнению с концентрацией в свободном растворе, и для того чтобы началось субстратное ингибирование иммобилизованного фермента, необходимо более высокое значение концентрации субстрата, чем в случае фермента в разбавленном растворе.
Т.о. нами было исследовано влияние природы подложки на активность иммобилизованного фермента и экспериментально установлено, что наилучшими характеристиками обладает гетерогенезированный носитель на основе аэросила и казеина, сохраняющий 72% удельной активности нативной пероксидазы.
Синтезированный препарат иммобилизованной пероксидазы может найти применение в медицине и ветеринарии в качестве лабораторного диагностикума ряда заболеваний.
Список литературы
1.
Воробьева О.В., Кунижев С.М., Анисенко О.В., Фильм А.А., Бородина Т.Н. Способ получения сорбента / Воробьева
О.В., Кунижев С.М., Анисенко О.В., Фильм А.А., Бородина Т.Н. Патент №2257951, 2004.
2. Газарян И.Г., Хушпульян Д.М., Тишков В.И. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений / Газарян И.Г.,
Хушпульян Д.М., Тишков В.И.
- 2006. - С.303.
3.
Давыдова
Г.Ф., Ермаков О.А., Панасенко А.И., Тищенко А.М. Лекарственные препараты
из растительного сырья. Пероксидаза // Давыдова Г.Ф. Химия растительного сырья. - 1998. - №1. - С.15-18.
4. Сахаров И.Ю. Использование новых пероксидаз растений в иммуноферментном анализе с хемилюминесцентной детекцией. II Биохимические методы анализа // Под ред. Дзантиева Б.Б. - Наука: Москва, 2010.
5. Стом Д.И., Забелина Т.В., Балаян А.Э., Саксонов М.Н. Способ определения активности пероксидазы / Стом Д.И., Забелина Т.В. Патент №1262350, 1986.
