20 мая 2016г.
Бактериофаг - ультрамикроскопический, внутриклеточный облигатный паразит - вирус, лизирующий бактерии и актиномицеты. Впервые явление бактериофагии наблюдал в 1898 г. Н.Ф. Гамалея, позднее - Туорт в 1915 г. и д'Эрелль в 1917г. Бактериофагу присуща наследственность, изменчивость, приспособляемость и другие свойства вирусов. Они несут всю информацию необходимую для процесса их репродукции в соответствующих клетках, но не имеют собственного механизма для генерации энергии и рибосом для синтеза белков. Корпускулы бактериофагов имеют форму сперматозоидов, состоят из сферической, цилиндрической или многогранной головки и короткого или длинного прямого или изогнутого отростка. Каждая фаговая частица (вирион) содержит геном представленный молекулой ДНК или РНК, заключенный в белковую или липопротеиновую оболочку (капсид), которые вместе формируют нуклеокапсид. В отростке фаговой корпускулы имеется футляр и центрально расположенный стерженек белковой природы, так хвостовой отросток напоминает иглу для шприца. На конце отросток имеет утолщение в виде пластинки, от которого отходят белковые нити диаметром не более 2 миллимикронов [2, 3]. Размер различных фагов колеблется от 0,1 µ в диаметре до 20 м µ [1], хвост фага в 1,5 раза длиннее головы и в 4 раза тоньше [3].
Бактериофаги широко распространены в природе. Почти везде, где условия обитания благоприятны для размножения бактерий и актиномицетов, удается обнаружить паразитирующие в их клетках бактериофаги. Они поражают более 140 различных родов бактерий. [2] Их можно обнаружить в организмах животных, а также в желудочно-кишечном тракте, на коже и слизистых человека, таким образом, фаги – нормальные симбионты тела человека [3]. Цыганова С.В. (2009) для выделения бактериофагов методом обогащения в качестве источников фагов использовала внутренние органы гусей и сточные воды птицехозяйства. Таким образом, выделить бактериофаг можно из различных материалов, где могли раньше или в данный момент присутствовать бактерии, на которых выделенный фаг размножается. При отсутствии подходящих хозяев многие фаги могут сохранять способность к инфицированию десятилетиями, если не будут повреждены внешними агентами.
Более 95% известных фагов принадлежит семейству Caudovirales - хвостатые фаги. Приблизительно половина массы их вирионов приходится на двухцепочечную молекулу ДНК, другую половину составляет белок. Вершина головки этих вирусов построена из большого числа копий пентамеров белка, а грани – из гексамеров того же или сходного белка – уложены плоскую в гексагональную решетку. Хотя для классификации используют около 40 критериев, для выделения отдельных родов и видов бактериофагов нет никаких универсальных признаков [2]. Серологические свойства и антигенный анализ фага являются одним из основных критериев для их классификации, но и этот способ не выявляет всей сложности и многогранности взаимоотношений между отдель- ными фагами. Нейтрализация фага гетерологической антифаговой сывороткой не является доказательством его родства с исходным фагом, так как сыворотки могут содержать групповые антитела против других фагов. В то же время перекрестная нейтрализация различными сыворотками также помогает уточнить вопрос об антигенной структуре фага и его родстве с другим.
В настоящее время для оценки степени родства между фагами предложено использовать опыты смешанной инфекции. В этих экспериментах бактериальный хозяин одновременно заражается двумя фагами, один из которых известен, а другой изучается по отношению к первому. Если в результате в бактериальной клетке размножаются оба фага, то можно полагать, что они находятся в генетическом родстве. При отсутствии последнего наблюдается взаимное исключение фагов, свидетельствующее об их отдаленности. Оценивая значение тех или иных признаков для классификации фага, Адамс и Вейд предлагают использовать четыре основных критерия для решения вопроса о тождестве или отличии изучаемых штаммов фага:
1. Серологическое родство.
2. Морфологическое сходство.
3. Подобие в физиологических свойствах.
4. Результаты опытов со смешанной инфекцией.
При этом авторы делают вывод, что трудно ожидать у родственных фагов однозначной характеристики по всем 4 пунктам. Адамс полагает, что достаточно совпадения двух признаков, а именно 1 и 2, 1 и 3 или 1 и 4 для возможности включения двух испытуемых фагов в одну группу [3].
Фаги можно разделить на две группы по типу жизненного цикла: вирулентные и умеренные. Большинство вирулентных фагов несут в себе гены белков, летальных для клетки-хозяина и размножение фага сопровождается выраженными цитологическими изменениями бактериальной клетки. Некоторые из них нарушают репликацию, транскрипцию или трансляцию; они также могут нарушать ДНК клетки, модифицировать клеточные ферменты, изменять клеточную мембрану [2]. В отдельных случаях, когда оболочка бактерий отличается необычной плотностью, лизис осуществляется путем медленного сморщивания клетки с просачиванием цитоплазмы через отверстие в оболочке. Кинетические исследования показывают, что синтез фаговой ДНК начинается вскоре после заражения и что в это же время бактериальная ДНК разрушается, а затем ресинтезируется уже в виде фаговой ДНК, которая продуцируется со скоростью, достаточной для образования 6-8 фаговых частиц в 1 минуту на одну бактериальную клетку [1]. Вирулентные фаги способны размножаться только посредством литического цикла, в котором фаговая частица адсорбируется на поверхности клетки хозяина и вводит в нее свой геном, под контролем которого часть клеточного метаболизма переключается на производство новых фаговых частиц. Не ранее середины латентного периода инфицированная клетка лизируется, высвобождая множество фаговых частиц. Умеренные фаги, в дополнение к литическому пути, могут выбирать так называемый лизогенный путь. В большинстве инфицированных клеток умеренный фаг инициирует литический цикл, приводящий к лизису клетки и выходу новых фагов. Однако в некоторых случаях фаг может пойти по пути лизогенизации: вместо немедленной репликации фаговый геном принимает покоящуюся форму, называемую профагом, часто интегрированную в бактериальный геном, но иногда существующую и в виде плазмиды, и ведущую себя как нормальная составная часть клетки. Такая форма способна существовать сколь угодно долго, реплицируя геном вируса в процессе деления клетки. Такие бактерии называют лизогенными. Умеренные фаги помогают защищать клетку хозяина от инфицирования другими фагами, и присутствие профага в определенном участке бактериальной хромосомы вызывает значительные изменения свойств хозяина, включая систему рестрикции- модификации, устойчивости к антибиотикам и влияниям окружающей среды. Они всегда несут репрессорный белок, блокирующий транскипцию других генов фага, а также блокирует литическую инфекцию другими фагами из той же группы иммунности – то есть фагами, чьи гены могут регулироваться тем же репрессором. Лизогенная система очень устойчива, и только при нарушении равновесия, вызванного сильнодействующими веществами, лизогенная бактерия может образовывать фаговые частицы. Превращение профага в фаг сопровождается гибелью клетки-хозяина. Таким образом, как для вирулентных, так и для умеренных фагов, финал жизненного цикла – клеточный лизис, время которого контролируется биологией фага. Если лизис происходит слишком рано, то будет собрано очень мало новых фагов для эффективного продолжения цикла; если лизис откладывается надолго, то возможности для инфекции новых клеток и нового цикла репродукции будут упущены [1, 2].
Фаголизис бактерий на жидких средах и образование колоний фага на агаре являются конечным результатом сложной реакции взаимодействия фага с бактерией. Это взаимодействие слагается из ряда этапов, началом которых является адсорбция фага на бактерии. При изучении адсорбции различных фагов на бактерии была показана зависимость этого процесса от ряда факторов и в первую очередь от физиологического состояния бактерий и состава среды, ее вязкости и окружающей температуры. В различные фазы роста и размножения бактериальных клеток их способность адсорбировать фаг неодинакова. Способность адсорбировать фаг сохраняется у убитых бактериальных клеток, правда в этом случае она значительно меньше, чем у живых. Фаг адсорбируется также на обломках бактерий, следовательно, лизаты необходимо центрифугировать при небольшом количестве оборотов в минуту, что предотвращает снижение титра при хранении [1].
Из сказанного можно сделать вывод, что адсорбция фага на бактериальной клетке представляет собой сложный процесс, зависящий от свойств среды и физиологических особенностей микроорганизма, из которых ведущее значение для фагорецепторной функции имеет антигенное строение бактерий.
Активность бактериофага обычно оценивают по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или твердых средах и выражают это тем максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема.
Характеристика активности фага всегда должна рассматриваться с учетом конкретных, стандартных условий. Наиболее благоприятной для взаимодействия фага с клеткой является логарифмическая фаза роста куль- туры, в течение которой большинство особей жизнедеятельно. По мере накопления в бактериальной популяции нежизнеспособных бактерий активность фага будет снижаться.
Возможность получения активных фагов с высокой концентрацией частичек зависит от ряда условий: свойств среды, особенностей культуры и биологии самого фага. Классическим методом повышения активности фага является периодическое пассирование его на определенной культуре, в результате чего имеет место адаптация фага к хозяину, что выражается в повышении его урожайности на клетках, т. е. в увеличении его титра. Обычно титр фага, регистрируемый после суточного пассажа, меньше титра, учитываемого через 5—6 часов после начала пассирования. Это зависит, как видно, от того, что размножившийся фаг в дальнейшем частично отмирает и концентрация его устанавливается на определенном уровне [3].
Имеются вещества (кофакторы адсорбции), стимулирующие адсорбцию фага на бактериальной клетке. К ним относят двухвалентные катионы (Са++, Mg++), одновалентные катионы, в частности Na+ (0,17М NaCl), триптофан, аминокислоту изолейцин. Аэрирование, изменение температуры инкубирования повышают адсорбцию фага на бактерии [5]. В целом распределение фаговых частиц среди бактериальных клеток подчиняется в определенных пределах закону Пуассона: все те факторы, которые затрудняют диффузию фага в среде (вязкость, температура), уменьшают его адсорбцию на клетке [3].
Список литературы
1. Адамс М. Бактериофаги. М.: Изд-во иностранной литературы, 1961. 527 с.
2. Бактериофаги: биологическое и практическое применение / Под ред. Э. Катер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир, 2012. 640 с.
3. Тимаков В. Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии. М.: Медгиз, 1958. 347 с.
4. Цыганова С. В. Выделение бактериофагов против возбудителей бактериальных болезней птиц и изучение их биологических свойств: автореф. дис…канд. вет. наук. СПб, 2009. 23 с.
5. Anderson T. F. The role of tryptophane in the adsorption of two bacterial viruses on their host, E.coli. J. Cellular Comp. Physiol., 25, 17, 1945.
