ИНТЕРПОЛИМЕРНЫЕ КОМПЛЕКСЫ ИНСУЛИНА С ХИТОЗАНОМ

Сахарный диабет относится к группе эндокринных заболеваний, детерминированных абсолютной или относительной (нарушение взаимодействия с клетками-мишенями) недостаточностью гормона инсулина, в результате чего развивается гипергликемия — стойкое увеличение содержания глюкозы в крови. В настоящее время около 3% населения планеты страдают сахарным диабетом и из них 10-15% случаев относятся к сахарному диабету 1-го типа (Bhumkar D. et al., 2007). Больные вынуждены строго контролировать содержание глюкозы в крови путем ежедневных инъекций инсулина или другими инвазивными методами приема гормона. Недостатками такого введения являются сильные болевые ощущения.

Возможным альтернативным способом доставки гормона является его пероральное применение. Именно этим объясняется возрастание в мире интереса специалистов к формированию препаратов на основе инсулина для его перорального введения. Однако per’os введение инсулина в чистом виде не дает положительных результатов, поскольку белок подвержен разрушительному воздействию желудочного сока (низкие значения pH) и протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта.

Поэтому актуальным является решение задачи по защите молекул инсулина и созданию условий, обеспечивающих поступление  активного  агента  в кровь.  В этом  отношении перспективным представляется синтез наноструктурированных комплексов, в которых молекулы пептида были бы экранированы полимерными слоями такого состава, который бы обеспечивал одновременно с защитной транспорт гормона в русло крови.

Для выполнения этих функций нами был выбран природный аминополисахарид хитозан, представляющий собой деацетилированное производное хитина. Использование полимера обусловлено его биологическими свойствами, которые позволяют отнести хитозан к группе парафармацевтиков – природных веществ, обладающих выраженной фармакологической активностью. Производные хитозана биосовместимы и биоразрушаемы до привычных для организма веществ (N– ацетилглюкозамин или глюкозамин), обладают иммуномодулирующим, адьювантным, противомикробным, фунгистическим, противоопухолевым, радиозащитным, противовоспалительным,  липотропным,  антихолестерическим,  гемостатическим  действием.  Кроме  того, мукоадгезивные свойства хитозана позволяют ему выполнять транспорт биологически активного препарата через эпителиальные клетки кишечника.

В настоящий момент в ряде стран (Россия, США, Индия и др.) ведутся исследования, направленные на формирование композиций для пероральной доставки инсулина. В частности уже сформированы капсулированные формы гормона. Однако эффективность полученных препаратов составляет до 60%, что связано с крупными размерами комплексов (порядка 1000 нм), не позволяющими таким системам проникать в кровь (Balabushevich N. et al., 2013). Кроме этого, при инкапсулировании теряется до 70% пептида (Jintapattanakit

A.     et al., 2007), а также полученные комплексы неустойчивы к действию ферментов - разрушение до 40% (Finotelli Pr. Et al., 2010).

Актуальным является разработка стратегии получения мультикомпонентных систем размером до 20 нм, в которых бы было обеспеченно полное связывание инсулина и хитозана. Решение этих проблем – цель данного исследования.

Известно, что основные химические и физические свойства полиэлектролитов в значительной степени определяются пространственной организацией молекул. Поэтому было изучено влияние pH-среды на конформацию молекул инсулина методом Ленгмюра-Блоджетт. Эксперименты проводили на установке KVSMini, в которой датчиком поверхностного давления являются электронные весы Вильгельми. Ванну заполняли поочередно растворами HCl с известными значениями pH, равными: 4,7; 5,4; 6,2; что соответствует состоянию молекулы до изоэлектрической точки, в изоэлектрической точке pI=5,4 и после неѐ.

Полученные изотермы Ленгмюра имеют типичный вид для мономолекулярных слоев и приведены на Рисунке 1. По данным изотермам были определены: площадь, занимаемая молекулами инсулина в системе; площадь (a), занимаемая одной молекулой инсулина и модуль упругости (ε0) монослоев.

Из представленных изотерм видно, что наибольшую площадь молекулы инсулина занимают в изоэлектрической точке, что противоположно изолированным макромолекулам полиэлектролитов, которые в этом состоянии обладают наиболее плотной конфигурацией. Это может быть объяснено строением самого белка. Инсулин представляет собой две связанные аминокислотные цепи. В изоэлектрической точке, когда молекула электронейтральна, происходит ожесточение структуры, вызванное наибольшим образованием водородных связей между незаряженными функциональными группами обеих цепей белка. Из-за этого формируется пространственно вытянутая конформация, характеризующаяся наибольшей протяженностью (Табл.1). При переходе в кислую или щелочную среды относительно pI молекулы белка теряют электронейтральность. Две аминокислотные цепи неравнозначно приобретают заряд из-за различного состава. Это позволяет одной цепи частично «выталкивать» вторую с поверхности жидкой фазы в газовую, тем самым уменьшая площадь монослоя (Balashev K. et al., 2011). В таких состояниях потенциально реакционно-способные группировки могут оказаться в заслоненном положении, что приведет к снижению способности инсулина к образованию комплекса с хитозаном.

Площадь одной молекулы белка, как и площадь всего монослоя, максимальна в изоэлектрической точке и уменьшается при любом отклонении pH-среды от pI. Относительно модуля упругости проявляется обратная тенденция, в изоэлектрической точке он минимален.

Таблица 1 Результаты расчетов по определению площади монослоя инсулина; площади одной молекулой и модуля упругости мономолекулярных слоев при различных значениях pH-среды.

Значение pH-среды также влияет и на структуру хитозана, для которого характерен конформационный переход клубок-спираль. При низких значениях pH макромолекула хитозана приобретает структуру рыхлого клубка из-за высокой степени протонирования аминогрупп, исключающей образование внутрицепных водородных связей, и их электростатического отталкивания. Но при повышении pH(≥4,5) наблюдается тенденция к внутримолекулярному связыванию непротонированных аминогрупп, и макромолекула приобретает конформацию спирали.

Таким образом, наиболее благоприятным условием для образования комплекса инсулин-хитозан является значение pH=pI. В этом случае оба партнера имеют протяженные конформации, обеспечивающие лучшую доступность функциональных групп к взаимодействию посредством межмолекулярных связей.

Из представленных спектров (Рисунок 2) видно, что происходит изменение соотношения интенсивностей пиков инсулина и наблюдается батохромный сдвиг первого пика белка (216 нм→225 нм). Это может свидетельствовать о связывании хитозана и инсулина в комплекс. Наибольшие изменения в спектрах происходят при pH=5,36.  Последующее увеличение  pH-среды  приводит к уменьшению эффективности связывания, что обусловлено ассоциацией молекул хитозана вследствие потери растворимости.

Совокупность представленных результатов выявляет условия формирования комплекса инсулин-хитозан, обеспечивающие полноту связывания компонентов. Это является основой для создания композиции состава инертное ядро-хитозан-инсулин с размерами до 20 нм, предназначенной для применения гормона per’os.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта (соглашение от 27 августа 2013 г.) № 02.В.49.21.0003 между МОН РФ и ННГУ.

Список литературы

1.     Balabushevich N., Pechenkin M., Shibanova E., Volodkin D., Mikhalchik E. Multifunctional polyelectrolyte microparticles for oral insulin delivery // Macromolecular Bioscience.- 2013.- T13,№10. – р.1379-1388.

2.     Balashev K., Ivanova Tz., Mircheva K., Panaiotov I. Savinase proteolysis of insulin Langmuir monolayers studied by surface pressure and surface potential measurements accompanied by atomic force microscopy (AFM) imaging// Journal of Colloid and Interface Science.- 2011.-№360. – р.654-661.

3.     Bhumkar D., Joshi H., Sastry M., Pokharkar V. Chitosan Reduced Gold Nanoparticles as novel carriers for transmucosal delivery of insulin // Pharmaceutical Research. - 2007.- Vol.24, №.8. – p.1415-1426.

4.     Finotelli Pr., Silva D., Sola-Penna M., Rossi Al. Microcapsules of alginate/chitosan containing magnetic nanoparticles for controlled release of insulin // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces.- 2010.- №81. – p. 206-211.

5.     Jintapattanakit A., Junyaprasert V., Mao Sh., Sitterberg J., Bakowsky U. Peroral delivery of insulin using chitosan derivatives: A comparative study of polyelectrolyte nanocomplexes and nanoparticles // Pharmaceutical Nanotechnology. – 2007. –№342. – p. 240-249.