ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА В ОПЫТАХ IN VIVO ПРОТЕКТИВНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ МОДЕЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ, ИМИТИРУЮЩЕЙ СОСТАВ МЕТАБОЛИТОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ LACTOBACILLUS PLANTARUM 8Р-А3

Изучена возможность предотвращения развития псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза у конвенциональных белых мышей при пероральном введении модельной композиции, имитирующей состав метаболитов лактобацилл Lactobacillus plantarum 8Р-А3.

Конвенциональных белых мышей инфицировали перорально культурами возбудителей псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза и оценивали развитие инфекционного процесса. Модельную композицию вводили подопытным животным перорально два раза в сутки через 2 и 24 часа после энтерального введения 10 LD50 культур патогенных бактерий. Генерализация инфекционного процесса подтверждена бактериологически и гистологически, а также выделением чистой культуры бактерий из внутренних органов погибших животных.

Установлена выраженная антибактериальная активность модельной композиции in vitro и протективная эффективность в опытах in vivo, предотвращающая развитие псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза у подопытных животных.

Ключевые слова: псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз, эшерихиоз, дисбактериоз, лактобациллы, метаболиты, белые мыши.

Пробиотикотерапия является наиболее изученным направлением восстановления дисбиотических нарушений кишечника, в том числе развившихся на фоне антибиотикотерапии [11,с.61-68]. Сами по себе пробиотики – это непатогенные микроорганизмы, которые при введении в организм в определенных дозах могут оказывать на него  положительное влияние [12,с.20]. Но даже при длительном  применении пробиотиков их положительный эффект носит временный характер или полностью  отсутствует [7,с.77-84]. Сочетанное применение при дисбактериозах пробиотикотерапии и антибиотикотерапии существенным образом ситуацию не изменило. Указанные обстоятельства привели к пересмотру концепции пробиотикотерапии [8,с.180-188]. Коммерческие пробиотические препараты, поступающие в аптечную сеть, стали рассматриваться в качестве первого поколения препаратов для коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике, а сами пробиотические микроорганизмы – стартовыми штаммами, продуцирующими метаболиты и/или сигнальные молекулы с определенной структурой, на основе которых планируется создание метабиотиков для предотвращения и лечения заболеваний кишечника [13].

В практическом плане, с точки зрения реализации идеи использования микробных метаболитов для восстановления кишечной микробиоты, важное значение имеют экспериментальные данные, в ходе которых был изучен состав надосадочной жидкости нативной культуры L. plantarum 8Р-А3, определена ее антибактериальная активность в опытах in vitro и in vivo [9,с.71-79]. Полученные результаты дают основание полагать, что микробные метаболиты можно использовать для повышения колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника, нормализации дисбиотических изменений кишечной микробиоты.

Цель исследования.

Изучение возможности предотвращения развития псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза у инфицированных конвенциональных белых мышей при пероральном введении животным модельной композиции, имитирующей состав метаболитов лактобацилл L. plantarum 8Р-А3.

Материалы и методы.

В  экспериментах  по  моделированию  кишечных  инфекций  у  конвенциональных  белых  мышей использовали: кальцийзависимый штамм 147 Yersinia pseudotuberculosis I серотипа, содержащий плазмиду с молекулярной массой 47 МД, величина LD50   при пероральном введении составляет 8,5·104  КОЕ [5,с.59-62]; кальцийнезависимый штамм 1407 Yersinia enterocolitica серотипа 0:9, содержащий плазмиду с молекулярной массой 42 МД, величина LD50 при пероральном введении составляет 7,5·107  КОЕ; штамм Escherichia coli GE энтероинвазивного возбудителя эшерихиоза, величина LD50 при пероральном введении составляет 8,9·107 КОЕ. Псевдотуберкулезный микроб с учетом его психрофильности выращивали на агаре Хоттингера при температуре (4-5) ºС, бактерии кишечного иерсиниоза - при температуре 24 ºС, бактерии эшерихиоза - при температуре 37 ºС. Штамм лактобацилл L. plantarum  8Р-А3 выделен  из лиофилизированного пробиотического препарата

Лактобактерин (производство ФГУП НПО «Микроген», Россия). Выращивание лактобацилл в жидкой питательной среде проводили в микроаэрофильных условиях при температуре 37 ºС. Компонентный состав надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл определяли методом газожидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием с использованием капиллярной колонки СВ-WАХ58.

Морфологические исследования проводили на 7-8 сутки эксперимента. Для исследования отбирали фрагменты слепой кишки, печени, почек, легких. Ткани фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обезвоживали в изопропаноле и заливали в парафин. Препараты окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином, исследовали под микроскопом «Микмед-2» (ООО «ЛОМО», Россия) при увеличении х200-х1000.

В работе использовали прошедших акклиматизацию конвенциональных белых мышей массой 18-20 г в количестве 90 особей.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили согласно рекомендациям, изложенным в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [3,с.280].

Результаты и обсуждение.

Изучение антибактериальной активности надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 в опыте in vitro с использованием диско-диффузионного метода [2,с.40-44] выявило ее довольно высокую активность в отношении растущих культур псевдотуберкулезного микроба, иерсиний и эшерихий (Рисунок 1). Вокруг тест-объектов, пропитанных надосадочной жидкостью, формируются выраженные зоны ингибирования роста иерсиний псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, а также энтероинвазивных эшерихий. При этом зоны ингибирования роста бактерий Y. enterocolitica 1407 и E.coli GE существенно больше таковой для бактерий Y. pseudotuberculosis 147.

На основании анализа образцов надосадочной жидкости методом Газожидкостной хроматографии показано, что ведущим ее компонентом является молочная кислота, составляющая 70 % от общего количества метаболитов. Вторым значимым компонентом надосадочной жидкости, содержание которого достигает 14 %, являются соли фосфорной кислоты. Остальные компоненты, составляющие в сумме 16 % от общего количества, включают аминокислоты (валин, треонин, аспарагиновая кислота), одноосновные карбоновые кислоты (масляная, пропионовая, бутандиоловая и др.), многоатомный спирт, сахара [10;с.131-139].

С учетом данных о количественном составе компонентов надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 была разработана композиция, имитирующая состав метаболитов в надосадочной жидкости, при следующем соотношении компонентов (масс. %): молочная кислота 3·10-6 г, калий фосфорнокислый однозамещенный 5·10-7 г, аминокислоты (валин 6·10-8 г, треонин 7·10-8 г, аспарагиновая кислота 7·10-8 г), жирные кислоты (масляная 5·10-8 г, пропионовая 5·10-8 г, бутандиоловая 6·10-8 г), сорбит 1·10-7 г, галактоза 1·10-7 г, тиамина хлорид (витамин В1) 7·10-8 г, кальция пантотенат (витамин В5) 7·10-8 г, рН раствора 3,9-4,1 ед. рН.

В сравнительных опытах определения антибактериальной активности разработанной композиции и надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3 в отношении иерсиний псевдотуберкулеза, бактерий кишечного иерсиниоза и эшерихиоза в качестве контролей были использованы растворы калия фосфорнокислого однозамещенного (рН 4,0) и соляной кислоты (рН 4,1). Результаты эксперимента, в котором в качестве тест-штамма использована культура Y. pseudotuberculosis 147, представлены на Рисунке 2.

Как следует из представленного Рисунка 2, вокруг тест-объекта, пропитанного водным раствором разработанной композиции, формируется обширная зона ингибирования роста бактерий псевдотуберкулеза, значительно превышающая аналогичную зону, сформированную под влиянием надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл. Особо необходимо отметить, что раствор калия фосфорнокислого однозамещенного (рН 4,0), как и раствор соляной кислоты (рН 4,1), в тех же условиях не проявляли антибактериальной активности в отношении иерсиний псевдотуберкулеза.

Бактерии кишечного иерсиниоза и эшерихиоза так же, как и бактерии псевдотуберкулеза проявили высокую чувствительность к антибактериальной композиции и в меньшей степени к компонентам надосадочной жидкости нативной культуры лактобацилл L. plantarum 8Р-А3.

Оценку протективной эффективности разработанной антибактериальной композиции проводили в экспериментах in vivo на конвенциональных белых мышах. Животные были разделены на 9 групп по 10 особей в группе. Суспензию бактерий, вызывающих кишечное заболевание (псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз, эшерихиоз), вводили через рот (реr оs) двум опытным и одной контрольной группам животных. В последующем животным опытных групп через 2 ч и 24 ч после инфицирования возбудителем кишечной инфекции перорально вводили разработанную антибактериальную композицию в объеме 0,2 мл однократно в течение 7 дней. Животным контрольных групп введение антибактериальной композиции не производили. Наблюдение за всеми группами животных осуществляли в течение 21 дня, отмечая исход инфицирования. В Табл.1 приведены результаты инфицирования конвенциональных белых мышей.

Таблица 1 Протективная эффективность антибактериальной композиции при пероральном инфицировании конвенциональных белых мышей возбудителями псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза (Х±I95, n=6)

Порядков ый номер	Группа животных	Заражающая доза, КОЕ	Начало введения антибактери альной композиции , ч	Количество животных, особей		Сроки гибели, сутки, `Х (хmin – xmax)
				взятых в опыт	павших от кишечной инфекции
1	Опытная	Y.pseudotuberculosis 147 10 LD50 (8,5±0,9)·105	2	10	0	-
2	Опытная		24	10	0	-
3	Контрольная		-	10	10	9,7 (7-15)
4	Опытная	Y.enterocolitica 1407 10 LD50 (7,5±1,1)·108	2	10	0	-
5	Опытная		24	10	0	-
6	Контрольная		-	10	9	10,8 (8-17)
7	Опытная	E.coli GE 10 LD50 (8,9±1,2)·108	2	10	0	-
8	Опытная		24	10	0	-
9	Контрольная		-	10	8	12,1 (8-17)

 

Представленные в таблице результаты свидетельствуют о том, что от псевдотуберкулеза погибли все 10 белых мышей контрольной группы в срок от 7 до 15 суток, от кишечного иерсиниоза погибло 9 из 10 взятых в опыт животных контрольной группы в срок от 8 до 17 суток, от эшерихиоза погибло 8 из 10 взятых в опыт животных контрольной группы в срок от 8 до 17 суток. От всех погибших животных из внутренних органов были выделены культуры бактерий, которыми инфицировали животных.

Из фекалий погибших животных культура Y.pseudotuberculosis 147 выделялась в количестве (2,6-6,6)·10⁵КОЕ·г-1, культура Y.enterocolitica 1407 – в количестве (6,8-7,1)·10⁵ КОЕ·г-1, культура E.coli GE – в количестве (3,7-4,1)·10⁵ КОЕ·г-1.

Животные всех опытных групп, которым после инфицирования перорально вводили антибактериальную композицию в режиме профилактического и лечебного курсов, оказались защищенными от патогенных иерсиний и эшерихий и не погибли.

Гистологическое изучение органов погибших животных показало, что основные патологические изменения локализованы в толстой кишке. Как следует из представленного Рисунка 3, стенка кишки равномерно истончена, местами с выраженными нарушениями целостности клеточных структур, слизистая оболочка некротизирована, оставшиеся клетки железистого эпителия с выраженными дистрофическими изменениями, в просвете кишки выявляются некротические массы (Рисунок 3.1).

Патогистологические изменения в других органах животных, погибших от псевдотуберкулеза, являются следствием интоксикации организма микробными токсинами возбудителя, а также продуктами распада тканей. Так, в легких просветы альвеол свободные, межальвеолярные перегородки в целом тонкие, хотя некоторые утолщены; сосуды полнокровны, ткань легкого в отдельных полях зрения инфильтрирована клеточными элементами крови. Структура печени сохранена, сосуды полнокровны. В портальных трактах выявляется умеренная лимфо-гистиоцитарная инфильтрация, гепатоциты в перипортальных зонах с выраженными дистрофическими изменениями, в отдельных полях зрения встречаются порто-портальные некрозы. В почечных канальцах отчетливо просматривается зернистая дистрофия эпителия, некоторые клетки эпителия канальцев некротизированы и находятся в просвете канальца, а в клубочках определяются эритроциты. Описанные патогистологические изменения, наиболее ярко проявившиеся при псевдотуберкулезе, характерны и для манифестных форм кишечного иерсиниоза и эшерихиоза.

Гистологическая картина толстой кишки у животных опытных групп, где не отмечено случаев их гибели после перорального введения антибактериальной модельной композиции, практически соответствует норме, а изменения минимальны (Рисунок 3.2).

Представленные в  настоящей работе данные гистологического исследования внутренних органов конвенциональных белых мышей, инфицированных перорально бактериальными суспензиями возбудителей псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза, во многом сходны с данными, описанными в научной литературе [1,с.412;4,с.197;6,с.256], подтверждая положение о том, что поражения органов пищеварительной системы не ограничиваются патологией кишечника, а распространяются на другие органы и системы.

Как известно, в цепи событий, происходящих после энтерального попадания патогенных иерсиний и эшерихий в чувствительный организм, подвижность бактерий и связанный с ней хемотаксис являются одними из важнейших факторов, облегчающих осуществление колонизации эпителия слизистой оболочки кишечника. Преодолев колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника, патогенные бактерии могут встроиться в микробный консорциум кишечника, образующий биопленку, что позволяет им осуществить адгезию к эпителиоцитам, размножиться и проникнуть в организм хозяина, доставив при этом молекулы токсинов в высоких концентрациях к рецепторам на клеточных мембранах.

В случае предотвращения адгезии кишечных патогенов исключается начальный этап инфекционного процесса. Именно этот начальный этап инфекционного процесса при инфицировании конвенциональных белых мышей суспензиями возбудителей псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза купируется после перорального введения животным разработанной модельной антимикробной композиции, имитирующей состав метаболитов лактобацилл L.plantarum 8Р-А3 в нативной культуре. Оптимально подобранный компонентный состав антибактериальной композиции проявил свою активность как в опытах in vivo на конвенциональных белых мышах, так и в опытах in vitro при определении зон задержки роста бактерий Y.pseudotuberculosis 147, Y.enterocolitica 1407, E.coli GE.

Гистологические исследования толстой кишки и других внутренних органов погибших и выживших конвенциональных белых мышей также свидетельствуют о наличии у модельной композиции протективной эффективности, предотвращающей развитие у инфицированных животных кишечного заболевания и его генерализацию. Действительно, у выживших после инфицирования патогенными иерсиниями и эшерихиями конвенциональных белых мышей, которым перорально вводили модельную композицию, были зафиксированы минимальные изменения в кишечнике и в других органах. Фактически патогенные микроорганизмы, адгезируясь на неперевариваемых остатках пищи, пополняют сообщество просветной кишечной микрофлоры и удаляются вместе с кишечным содержимым из организма.

Выводы.

1.    Разработан состав модельной антибактериальной композиции, имитирующий метаболиты нативной культуры лактобацилл L.plantarum 8Р-А3, включающий молочную кислоту, калий фосфорнокислый однозамещенный, аминокислоты (валин, треонин, аспарагиновая кислота), жирные кислоты (масляная, пропионовая, бутандиоловая), сорбит, галактозу, витамины В1 и В5.

2.      С использованием дискодиффузионного метода в опытах in vitro выявлена антибактериальная активность модельной композиции в отношении возбудителей псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза, превосходящая антибактериальную активность надосадочной жидкости нативной культуры L.plantarum 8Р-А3.

3.    В экспериментах на конвенциональных белых мышах изучена возможность предотвращения развития псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза и эшерихиоза при пероральном введении животным возбудителей Y.pseudotuberculosis 147, Y.enterocolitica 1407, E.coli GE, путем повышения колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника.

4.   Установлена протективная эффективность модельной антибактериальной композиции при пероральном введении конвенциональным белым мышам, зараженным энтерально суспензиями бактерий Y.pseudotuberculosis 147, Y.enterocolitica 1407, E.coli GE в дозе, соответствующей 10 LD50.

5.        Результаты   экспериментальных   исследований,   связанные   с   повышением   колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника конвенциональных белых мышей под влиянием перорально вводимой модельной антибактериальной композиции, имитирующей метаболиты лактобацилл L.plantarum 8Р-А3, убедительно свидетельствуют о возможности конструирования нового класса лечебно-профилактических препаратов на основе синтетических аналогов микробных метаболитов – перспективных средств терапии инфекционно-воспалительных заболеваний кишечника.

 

Список литературы

1.     Андрейчин М.А., Ивахив О.Л. Бактериальные диареи // Киев: Здоровье, 1998. – 412 с.

2.     Афиногенов  Г.Е.,  Краснова  М.В.,  Афиногенова  А.Г.  Сравнение  методов  оценки  эффективности дезинфектантов и антисептиков // Дезинфекционное дело. – 2008. – № 4. – С. 40-44.

3.     Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Л.: Медгиз.– 1962. – 280 с.

4.     Борисова М.А. Клиника иерсиниозов // Владивосток: Изд-во ДВГУ, 1991. – 197 с.

5.     Маракулин И.В., Дармов И.В., Погорельский И.П. и др. Экспериментальная модель псевдотуберкулезной инфекции у обезьян // Бюл. эксп. биол. и мед. – 1994. – Т. 118, № 7. – С. 59-62.

6.     Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н. и др. Псевдотуберкулез. – 2-е изд. перераб. и доп. // М.: Медицина, 2001. – 256 с.

7.     Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза // Эффективная фармакотерапия. – 2011. – № 3. – С. 77-84.

8.     Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Дармов И.В. и др. Пробиотики: вектор развития // Практическая медицина. – 2012. – № 3 (58). – С. 180-188.

9.     Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. и др. Оценка возможности профилактики, лечения и коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры при экспериментальном псевдотуберкулезе // Журн. инфектологии. – 2012. – Т. 4, № 4. – С. 71-79.

10. Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А. и др. Актибактериальная активность и состав надосадочной жидкости нативной культуры L.plantarum 8Р-А3 // Журн. междунар. медицины. – 2013. – № 1 (2). – С. 131-139.

11. Шевелева  М.А.,  Раменская  Т.В.  Современные  представления  о  применении  различных  групп пробиотических средств при антибиотикотерапии // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. – Т. 54, №№ 3-4.– С. 61-68.

12. Sanders M.E., Gibson G., Gill H.C. et al. Probiotics: their potential to impact human health. Council for Agricultural Science and Technology (CAST). Issue Paper, CAST, Ames, 2007. 20 p.

13. Shenderov B.A. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception // Microbial Ecology in Health and Disease. –2013. – Vol. 24: 20399. – http://dx.doi.org/10.3402/mehd.v24i0.20399 (дата обращения 10.11.2013).