26 февраля 2016г.
Первые попытки воспроизвести инсульт в эксперименте были предприняты в середине прошлого столетия, когда Хилл и соавторы [12] инъецировали сгусток крови в сонную артерию собаке. В настоящее время эта линия исследований сложилась в целостное экспериментально-клиническое направление, включающая различные подходы и методы.
Модели инсульта вполне эквивалентны данным человеческой клиники при том, что локальная окклюзия сосуда обычно поражает идентичные отделы головного мозга человека и животных [21]. При разработке модели учитываются сроки обратимого (первые 48 часов) и необратимого (3-7 дней) повреждения нервной ткани, а также сходные молекулярные механизмы нейропротекции и нейропластичности, влияние антагонистов NMDA- рецепторов, ингибиторов апоптоза и антигипоксантов [1]. Отметим, что сложная нейронная структура мозга и регуляция мозговой гемодинамики допускают разнообразные варианты развития инсульта и не позволяют моделировать его ни в клеточной культуре или на срезах мозга, ни с помощью компьютерных программ. Модели дают возможность гистопатологического, физиологического и биохимического анализа и получить данные об изменениях мозга в ранние сроки развития ишемии. Именно этот момент невозможно зафиксировать у человека ввиду вариабельности клинического течения и начала лечебных мероприятий. Вместе с тем, результаты экспериментальных исследований совершенно необходимы для разработки новейших терапевтических стратегий. Исследование экспериментальной ишемии показало, что половые различия моделей – фактор, оказывающий радикальное влияние на развитие и исход инсульта. Alkayed et al. в 1998г. [3] впервые сообщили о нейропротективной функции эндогенного эстрогена, повышающего жизнеспособность ишемизированной ткани. Позже эта закономерность была описана и для человека: среди мужчин инсульт встречается чаще, однако у женщин после менопаузы существенных расхождений уже не наблюдается. Установлено, что эстрадиол и прогестерон – мощные модуляторы нейротрофинов и посредством этого механизма защищают нейроны от эксайтотоксичности [11, 4, 18]. По этой причине прецизионную модель инсульта формируют только на самцах для исключения потенциального влияния на процесс женских половых гормонов.
В зависимости от способа редукции кровотока и патогенетического механизма инсульта все существующие методические подходы можно разделить на модели глобальной и фокальной ишемии.
Глобальная ишемия головного мозга развивается в результате нарушения кровоснабжения по всем магистральным сосудам и приводит к тотальному нарушению деятельности мозга. Как правило, она возникает при остановке сердца, острой гипотензии или острой кровопотери и позволяет исследовать повреждение нейронов в наиболее уязвимых участках новой коры, гиппокампа, стриатума и мозжечка [9]. Большинство моделей сводится к перевязке двух, четырех, семи или девяти артерий, питающих мозг. В некоторых моделях перевязку артерий сочетают с формированием системной гипотензии [2, 20]. Глобальную ишемию мозга моделируют также с помощью фармакологической блокады сердца, декапитации или тугой перевязки шеи лигатурой.
Фокальная ишемия возникает при снижении или полном прекращении кровотока в одном из церебральных сосудистых бассейнов и ее моделирование позволяет исследовать локальные изменения мозга и пенумбру – зону вторичного повреждения вокруг ядра инфаркта с обратимой жизнеспособностью [6].
Наиболее распространенной моделью фокальной ишемии является окклюзия средней мозговой артерии (СМА) ввиду еѐ релевантности инсульту у человека. Как правило, этот прием ведет к ишемии внутренней капсулы, подкорковых ядер и неокортекса и воспроизводится в двух вариантах. При дистальном варианте после краниотомии проводится прямая окклюзия СМА или фотохимический ее тромбоз, а проксимальный вариант допускает непрямую окклюзию СМА через внутреннюю сонную артерию (ВСА) введением в просвет сосуда различных окклюдеров или эмболов [22].
Методы прямой окклюзии СМА оказались сложны для оценки в виду низкой воспроизводимости модели и значительной вариабельности размеров очага инсульта. Кудо и соавторы [14] предложили вариант с введением в просвет церебральных артерий суспензии кровяного сгустка, вызывая эмболию сосуда. Однако при введении тромба в ВСА, кроме поражения бассейна СМА, появлялись эмболии бассейнов передней и задней мозговых артерий и даже в контралатеральном полушарии.
Очевидно, что максимум эффективности моделируемого процесса достигается с помощью управляемой тромбоэмболии или в еѐ сочетании с механической окклюзией СМА [16].
Как показали экспериментальные данные, размер тромба не всегда дает лучшие результаты по моделируемой ишемии. Если в одних случаях крупные размеры эмбола затрудняют его точное подведение в СМА [17], то в других – при использовании мелких эмболов в сочетании с селективной окклюзией СМА – обнаруживается ранняя реканализация тромба [22]. В обоих исследованиях полученные результаты отличались стертой клинической картиной, а отдаленные последствия инсульта полностью ускользали от внимания экспериментаторов. Нивелировать эти недостатки удалось Busch et al. в 1997 [7], тромбоэмболическая модель которых сложилось как гибрид указанных методик. Авторы вводили в просвет ВСА небольшое количество свертков крови средних размеров (1,5 х 0,35 мм). В результате формировалось патологическое состояние, сходное с инсультом при прямой перевязке ВСА.
В 1985 году Уотсон и сотрудники [19] усовершенствовали тромбоэмболическую модель на основе фотохимической реакции красителя бенгальского розового, вводимого в кровоток и инициирующего локальный тромбоз. Модель хорошо воспроизводится, но имеет и ограничения из-за различий в патофизиологических механизмах инсульта in vitro и in vivo.
В качестве универсальной модели фокальной ишемии для изучения регионарных нарушений кровообращения широко используется метод постоянной или временной окклюзии СМА путем введения в ее просвет филамента. Методика была предложена Коидзуми и соавторами [13] и в дальнейшем неоднократно модифицировалась [5,10,8]. Область ишемического поражения в охватывает латеральную поверхность хвостатого ядра и фронто-париетальную кору.
Мы провели сравнительное исследование наиболее распространенных моделей фокальной ишемии головного мозга на материале взрослых крыс-самцов линии Wistar. Эффективность модели оценивалась по следующим параметрам: воспроизводимость модели и длительность жизни оперированных животных, выраженность неврологического дефицита, идентификация редукции кровотока на срезах мозга с помощью 2,3,5- трифенилтетразолия хлорида (ТТХ-тест) и гистологическое исследование.
Оценка неврологического дефицита у крыс осуществлялась по шкале Garcia, по тестам «Открытое поле» и тест на удаление клейкой ленты с передних лап.
Сравнительный анализ результатов показал, что вариант филаментной окклюзии СМА оказался самым действенным среди всех моделей. У животных наблюдалась отчетливая симптоматика инсульта, положительный ТТХ-тест и гистологическое подтверждение.
Метод Коидзуми не является абсолютным для воспроизводства инсульта в эксперименте. Согласно литературным данным процент неудач составляет при нем до 20-30%, определяемых в основном несоответствием размера филамента и просвета ВСА [15]. Поэтому рассмотренные методы экспериментального инсульта не исключают вариантов комбинированного моделирования, что позволит избежать указанных недостатков каждой модели.
Данные сравнительной анатомии церебральных сосудов говорят о приемлемости крысиной модели инсульта. В тоже время значительная коллатеризация сосудов и равнозначность каротидного и вертебро- базилярного бассейнов в кровоснабжении мозга крыс, снижают эффективность любой модели.
Учитывая данный факт, мы предприняли попытку модификации методики филаментной окклюзии СМА, которая заключалась в дополнительной коагуляции крыло-небной артерии, которая у крыс является ветвью ВСА, а у человека в системе ветвей наружной сонной артерии (НСА). Такая манипуляция полностью исключает ретроградный и коллатеральный кровоток в ВСА после перевязки ОСА и НСА и представляется эффективным вариантом методики экспериментального инсульта.
Список литературы
1. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001. – 328 с.
2. Лунец Е.Ф., Власюк П.А. Модель острой тотальной ишемии головного мозга у кроликов. - В кн.: Рационализаторская работа в здравоохранении. БССР. 1974. с. 123-124.
3. Alkayed N.J., Harukuni I., Kimes A.S. at al. Gender-linked brain injury in experimental stroke // Stroke. - 1998. – V.29, № 1. – disc. 166. - P. 159-165.
4. Azcoitia I., Arevalo M.-A., De Nicola A.F., Garcia-Segura L.M. Neuroprotective actions of estradiol revisited // Trends in Endocrinology and Metabolism. - 2011, Vol. 22. - N.12. - P. 467-473.
5. Belayev L., Alonso O.F., Busto R., Zhao W., Ginsberg M.D. Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture: neurological and pathological evaluation of an improved model // Stroke. - 1996. - V27. - P. 1616-1623.
6. Bradley W.G., Daroff R.B., Fenichel G., Jankovic J. Neurology in clinical practice // Philadelphia: Butterworth- Heinemann. - 2008. – P. 2624.
7. Busch E., Kruger K., Hossmann K.A. Improved model of thromboembolic stroke and rtPA induced reperfusion in the rat // Brain Res. - 1997. - V.778. - P.16—24.
8. Casals J.B., Pieri N.C.G., Feitosa M. L.T. et al. The Use of Animal Models for Stroke Research: A Review // Comparative Medicine. – 2011. – V.61, № 4. – P. 305–313.
9. Dietrich W.D., Busto R., Bethea J.R. Postischemic hypothermia and IL-10 treatment provide long-lasting neuroprotection of CA1 hippocampus following transient global ischemia in rats // Exp Neurol. - 1999. – V. 158. – P. 444-450.
10. Durukan A., Tatlisumak T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia // Pharmacol. Biochem. Behav. - 2007. - No7 – P. 179– 197.
11. Gibson C.L., Coomber B., Murphy S.P., Progesterone is neuroprotective following cerebral ischaemia in reproductively ageing female mice // Brain. - 2011. – V.134. – P. 2125–2133.
12. Hill N.C., Millikan C.H., Wakim K.G., Sayre G.P. Studies in cerebrovascular disease, VII: experimental production of cerebral infarction by intracarotid injection of homologous blood clot: preliminary report. // Mayo Clin. Proc. – 1955. – V.30. – P. 625-633.
13. Koizumi J., Yoshida Y., Nakazawa T., Ooneda G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area, // Jpn. J. Stroke. - 1986. – V.8. – P. 1-8.
14. Kudo M., Aoyama A., Ichimori S., Fukunaga N. An animal model of cerebral infarction // Stroke. - 1982. – V.13. – P. 505-508.
15. Kuge Y., Minematsu K., Yamaguchi T., Miyake Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats // Stroke. - 1995. – V.26. - P. 1655 - 1658.
16. Mayzel-Oreg O., Omae Т., Kazemi M, Li F., Fisher M., Cohen Y., Sotak C.H. Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study // Magn. Reson. Med. - 2004. – V. 51. – P. 1232-1238.
17. Sereghy T., Overgaard K., Boysen G. Neuroprotection by excitatory amino acid antagonist augments the benefit of thrombolysis in embolic stroke in rats // Stroke. - 1993. – V. 24. – P. 1702.
18. Singh M., Su C. Progesterone, drain-derived neurotrophic factor and neuroprotection // Neuroscience. – 2013. – V. 239. – P. 84–91.
19. Watson B.D., Dietrich W.D., Busto R. Wachtel, M.S., Ginsberg, M.D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis // Ann. Neurol. - 1985. – V. 17. - P. 497 - 504.
20. Yonekura I., Kawahara N., Nakatomi H., Furuya K., Kirino T. A model of global ischemia in C57 BL/6 mice // J. Cereb. Blood Flow Metab. - 2004. – V. 24. - P. 151 - 158.
21. Zhang K., Sejnowski T.J. A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2000. – V. 97. – P. 5621–5626.
22. Zhang L., Zhang R.L., Jiang Q., Ding G., Chopp M., Zhang Z.G. Focal embolic cerebral ischemia in the rat // Nat. Protoc. – 2015. – V.10(4). – P. 539-547.
