Новости
09.05.2023
с Днём Победы!
07.03.2023
Поздравляем с Международным женским днем!
23.02.2023
Поздравляем с Днем защитника Отечества!
Оплата онлайн
При оплате онлайн будет
удержана комиссия 3,5-5,5%








Способ оплаты:

С банковской карты (3,5%)
Сбербанк онлайн (3,5%)
Со счета в Яндекс.Деньгах (5,5%)
Наличными через терминал (3,5%)

О СЛУЧАЙНЫХ ОШИБКАХ В КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОЛОГИИ*

Авторы:
Город:
Новосибирск
ВУЗ:
Дата:
20 января 2019г.

* Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 16-03-00345-ОГН «Наукометрическая оценка качества отечественных исследований в клинической иммунологии»).

 

 

Введение. Случайная ошибка результата (random error of result) – это компонент ошибки, который изменяется непредвиденным образом в ходе получения результатов проверки одного признака. Случайную ошибку результата проверки нельзя скорректировать [2]. Иное название данного явления – случайная погрешность или показатель воспроизводимости метода. Мерой случайной ошибки (СО) является коэффициент вариации (CV), то есть выраженное в процентах от средней (М) значение одного стандартного отклонения (SD) [1].

Говоря о клеточной иммунологии, мы имеем в виду только методы иммунофенотипирования лимфоцитов методом проточной цитометри (ПЦ) либо методом непрямой иммунофлюоресценции (ИФ), а точнее – вопрос выбора авторами отдельных исследований «второй платформы». В настоящее время в ПЦ принято называть метод одноплатформенным, когда абсолютные значения содержания субпопуляций лимфоцитов (либо других исследуемых клеток) получают на том же самом приборе с использованием специальных калибрующих частиц [4]. Метод называют двуплатформенным, когда на проточном цитометре получают относительные (процентные) данные, а пересчет их в абсолютные производят после проведения общего анализа крови на гематологическом анализаторе. CV самого проточного цитометра не более 1 %, а гематологических анализаторов – не более 3 %.

В странах Бенилюкса 10 лет проводилась работа по выяснению причин межлабораторных различий, в частности, сравнивались данные одно- и двуплатформенных технологий. Было выяснено, что при соблюдении всех условий методов, результаты использования этих двух технологий отличаются незначительно и не вносят существенного вклада в межлабораторные различия [7].

Масштабы и эффективность использования счетных камер

Создание счетных камер (СК) было очень важной вехой в развитии медицины, поскольку позволило развиться такой важной ее отрасли как клиническая гематология, позже появилось более прогрессивное медицинское оборудование – счетчики Коултера и Scepter, Automated visio-based counter. В 2009 г. фирма «Beckman Millipore» опубликовала результаты исследования, имевшего целью выяснить, какими методами подсчета клеток пользуются исследователи, работающие с перевиваемыми линиями клеток. Оказалось, что 71 % из 400 исследовательских коллективов используют счетные камеры, поскольку они обходятся клиникам существенно дешевле, чем приобретение счетчика Коултера.

Авторы в работе [8] протестировали CV всех четырех устройств при разной концентрации клеток. При низкой концентрации клеток (50000 кл/мл) счетчики Коултера и Scepter показывали CV соответственно в 5 % и 10 %, Automated visio-based counter и счетная камера соответственно CV в 42 % и 33 %. Начиная с концентрации в 250000 кл/мл и выше CV на графике для счетчиков Коултера и Scepter представляет собой прямую линию на уровне 3 %, в то время как два других устройства достигают в этой точке CV в 20 %.

Итак, в чем же конкретная опасность использования СК в клинической иммунологии?

Необходимо иметь в виду, что определение СО как M ± 1SD охватывает примерно 67 % повторных измерений этой же пробы, а чтобы судить о 95 % измерений (ошибка в 5 %), SD необходимо умножить на 1,96. В связи с этим, если СК имеет CV в 20 % и с ее помощью было измерена в пробе концентрация клеток как 1000 кл/мкл, необходимо смело удвоить значение СV и понимать, что значение в 1000 кл/мкл на самом деле не 1000 кл/мкл, а случайно полученное значение из интервала концентраций от 600 до 1400 кл/мкл. Если охватить все возможные результаты с ошибкой в 1 %, (3 SD), то этот интервал будет еще шире.

СО любого метода подсчета клеток также имеет ключевое значение в оценке результатов при использовании непараметрических статистических методов. Если не проводить предварительной обработки результатов, то любая компьютерная программа сочтет, что значения в 400 кл/мкл и 401кл/мкл – это разные значения и, соответственно, они получат разные ранги. В результате исследователи получат «достоверные» различия между сравниваемыми группами, хотя на самом деле их нет [2].

Гипотеза исследования

Содержание каких-либо клеточных групп, рассчитанные по относительным (процентным) значениям и по абсолютным значениям у одного и того же обследуемого индивида должны совпадать.1

Однако эмпирическая реальность показывает расхождение: например, в величине иммунорегуляторного индекса (ИРИ, т.е. отношения содержания CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов) в группах обследованных лиц, когда ИРИ рассчитывался по процентному содержанию CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов и по их абсолютному содержанию [3].

Авторы предполагают, что использование счетной камеры как компонента двуплатформенной технологии в исследовании клеточных субпопуляций в клинической иммунологии должно существенно увеличить дисперсию абсолютных показателей содержания субпопуляций лимфоцитов и привести к смещенным оценкам средних значений. Оценить степень смещения предлагается путем сравнения индексов ИРИ в группах сравнения, рассчитанных по относительным и абсолютным значениям.

Методы исследования

Дизайн исследования – ретроспективное, библиометрическое. Использован электронный архив журнала «Медицинская иммунология за 2008-2018 гг. В исследование включались оригинальные статьи, где авторами производился анализ лимфоцитарных субпопуляций человека как в процентах, так и в абсолютных цифрах.

В выборку публикаций для нашего исследования вошли 35 работ, где использовалась ПЦ. В семи из них было указано, что для определения абсолютного числа клеток использовался гематологический анализатор (в одной из них отмечено, что использовался гематологический анализатор либо одноплатформенный метод). В лабораторной практике единственной альтернативой СК является использование гематологического анализатора.

О четырех работах (из одной и той же организации) было заведомо известно, что для определения абсолютных значений использовалась СК Горяева. Кроме того, было выявлено восемь исследований с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции (ИФ), при этом в одном из них было указано применение гематологического анализатора. Исследование, в котором фенотипирование лимфоцитов проводилось «по методу Terasaki» было искючено из анализа.

Таким образом, из 43 публикаций, только в 8 был указан метод получения абсолютных значений содержания клеток.

Для расчета разницы между ИРИ, полученным по процентным (ИРИ%) и абсолютным значениям (ИРИабс), индекс рассчитывался по средним значениям процентного и абсолютного содержания CD4+- и CD8+-лимфоцитов. Если в работе приводилось несколько групп данных, то использовалось среднее значение ИРИ. Разница между полученными индексами оценивалась в процентах [2].

Результаты исследования

Наглядное представление полученных результатов можно получить с помощью графического анализа. Если сортировать все данные по убыванию и построить столбиковую диаграмму, то слева будут находиться работы, заведомо использовавшие СК. По величине расхождения ИРИ% и ИРИабс они показывают 66 %, 56 %, 54 % и 31 %. В этом же диапазоне находятся 3 работы, где ПЦ дополнялась неуказанным методом (33 %, 44 %, 58 %). В остальных работах из этой группы (20 публикаций) процент расхождения в среднем составил 9 (мин. 3 %, макс. 23 %): в упорядоченной группе он плавно возрастает от минимума к максимуму и завершается упомянутыми тремя «выбросами», примыкающими к группе работ, использовавших СК.

В исследованиях, где ПЦ сочеталась с использованием гематологического анализатора (13 публикаций), среднее значения расхождения составило 11 % (мин. 3 %, макс. 23 %) и они также плавно растут от 3 % к 23 %.В группе исследования, использовавших ИФ (6 статей), среднее расхождение составило 10 % (мин. 1 %, макс 18 %), 1 % был в одном исследовании, сообщившим об использовавшем гематологического анализатора.

 

1 Это в свое время послужило основанием известному гематологу и автору термина «гемограмма» В. Шиллингу (Schilling) ввести в индекс ядерного сдвига в содержании нейтрофилов, рассчитанный по относительным цифрам.


Направленность расхождения между ИРИ% и ИРИабс приближается к равновероятному состоянию: в 18 работах (42 %) разница между показателями обусловлена тем, что ИРИ% больше, чем ИРИабс, а в остальных работах наоборот: ИРИабс больше, чем ИРИ%.

Обсуждение результатов

Очевидно, что с ростом объема выборки направленность расхождения между ИРИ% и ИРИабс все более бы приближалась в 50 %, поскольку отклонения «вверх» и «вниз» от истинного значения при случайном процессе равновероятны. Четыре работы, где заведомо использовалась СК, являются как бы отрицательным контролем, в чей диапазон попадает еще 3 работы, где метод определения абсолютного содержания субпопуляций лимфоцитов не указывался. Следует иметь в виду, что обычное определение фенотипа лимфоцитов включает выявление 9-11 параметров, поэтому выявленное расхождение между относительными и абсолютными значениями распространяется также и на них. В силу этого результаты упомянутых семи работ определенно являются сомнительными.

В одной из работ, использовавших гематологический анализатор, отклонения составили 3 %, поскольку авторы сравнивали на одних и тех же клетках два набора моноклональных антител разных производителей, что подразумевает минимальную дисперсию результатов.

Использование СК как второй компоненты в проточной цитометрии показывает слабую информированность иммунологического сообщества о таком явлении как случайная ошибка. Ранее нами было показано, что информированность сообщества авторов «Иммунологии» в 1980-1991 гг. о случайной ошибке меньше, чем сообщества авторов «Journal of Immunology» в 10,75 раз (95 % ДИ 5.61 – 21.28) [7]. Данный показатель оценивался по частоте упоминаний СО в тексте статей, не связанных с оценкой новых методов. При этом в статьях, использовавших непараметрические критерии, при сравнении отношений медиан (или средних, эта ошибка нередка и за рубежом) в 220 отечественных статьях и 211 статьях из «Journal of Immunology» было определено, что авторы из J. of Immunol. не считали результаты анализа статистически значимым, если это отношение было менее 1,47. В «Иммунологии» же авторы 96 статей сообщали о «достоверных» (р < 0.05 или менее) результатах при соотношении опыт/контроль менее 1,47, в том числе в 12 работах менее 1,1 [7]. При этом в отечественных публикациях частота упоминаний СО и частота работ с отношением опыт/контроль менее 1,47 была отрицательно ассоциированы: величина меры Гудмена и Краскела составила -0,985 (95 % ДИ -0,976- -0,985), меры Юла – -0,842 (95 % ДИ -0,793- - 0,891), в обоих случаях р < 0,001. Для англоязычных публикаций эти показатели были статистически не значимы.

Выводы

Библиометрический и контекстный анализ публикаций журнала «Медицинская иммунология» за 2008-2018 гг. показывает, что не менее 16 % публикаций, использовавших метод проточной цитометрии, в качестве компонента двуплатформенной технологии использовали счетную камеру, что приводит к некорректности полученных результатов.

 

Список литературы

 

1.        ГОСТ Р 50779.10-2000 (ИСО 3534.1-93) Статистические методы. Вероятность и основы статистики. Термины и определения.

2.        Гржибовский А. М. Использование статистики в российской биомедицинской литературе // Экология человека. 2008; 12: 55-64.

3.        Мусатов М. И., Лугачева Л.И. Наукометрическое исследование публикаций журналов «Иммунология» и «Journal of Immunology» //Вестник развития науки и образования, 2009, № 1, с.17-25.

4.        Хайдуков С. В., Байдун Л. В., Зурочка А. В., Тотолян Арег А. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов // Российский иммунологический журнал. 2014; 8(4): 974-92.

5.        Хаитов Р. М., Ильина Н. И., ред. Аллергология и иммунология: национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. 659 с.

6.        Filimberti E., Degl'Innocenti S., Borsotti M., Quercioli M., Piomboni P., Natali I., Fino M. G., Caglieresi C., Criscuoli L., Gandini L., Biggeri A., Maggi M., Baldi E. High variability in results of semen analysis in andrology laboratories in Tuscany (Italy): the experience of an external quality control (EQC) programme // Andrology, 2013 .Volume 1, Issue 3. https://doi.org/10.1111/j.2047- 2927.2012.00042.x].

7.        Levering W. H. B. M., van Wieringen W. N., Kraan J., van Beers W. A. M., Sintnicolaas K, van Rhenen D. J., Gratama J. W. Flow cytometric lymphocyte subset enumeration: 10 years of external quality assessment in the Benelux countries. Cytometry Part B, 2008; 74B (2): 79–90.

8.        Ongena K, Das C, Smith JL, Gil S, Johnston G. Determining cell number during cell culture using the Scepter cell counter // J Vis Exp 2010 Nov 26; (45). pii: 2204. doi: 10.3791/2204; PMCID: PMC3335093.