31 января 2016г.
Увеальная меланома (УМ) одна из наиболее часто встречающихся внутриглазных злокачественных опухолей [10]. Меланома первично хороидальной локализации составляет 5-6% от диагностируемых меланом всех локализаций, являясь второй по распространѐнности после кожной [12]. Несмотря на значительный прогресс в области лучевой и химиотерапии УМ, примерно у 40-50% пациентов с большим первичным опухолевым узлом развиваются отдаленные метастазы, а смерть от опухолевой прогрессии наступает в первые годы после операции [4]. Исходя из особенностей строения глаза (а именно отсутствие лимфатического дренирования увеального тракта) УМ метастазирует только гематогенным путѐм преимущественно в печень (95%), легкие (24%), кости (16%) и кожу (11%) [6].
На сегодняшний день активно изучаются морфологические и иммуногистохимические маркеры УМ с целью прогнозирования течения заболевания и определения чувствительности опухоли к проводимой терапии [7]. В последние десятилетие ведется активный поиск новых ИГХ-маркеров, выявляющих возможность раннего выявления отдаленных метастазов (например, высокая экспрессия Ki67 и p53 соответствует IIIC и IV стадии) [8].Параллельно с этим ведутся дальнейшие исследования патогенеза УМ с использованием генетической и ИГХ- диагностики (например, p16INK4a и TGFb) [1]. Тем не менее, ни в одном из исследований не было получено однозначных данных о связи экспрессии p16INK4a и p53 на митотическую активность опухоли. Более того, на данный момент отсутствуют работы, изучающие взаимосвязь экспрессии TGFb на p16INK4aв зависимости от пролиферативной активности, что необходимо учитывать наравне со стадией заболевания для рационального назначения таргетной терапии.
В связи с этим целью нашей работы стало изучить иммуногистохимические особенности меланомы первичной хороидальной локализации в зависимости от митотической активности опухоли.
Материал и методы. Исследован операционный материал от 42 пациентов с меланомами хороидальной локализации. В исследования включались беспигментные (4 случая), слабо (28 случаев) и неравномерно пигментированные (10 случаев) опухоли. Среди взятого материала 21 веретеноклеточных, 8 эпителиоидноклеточных и 13 смешанноклеточных меланом. Среди 42 наблюдений - 24 мужчины и 18 женщин, возраст которых находится в диапазоне от 15 до 74 лет (основной возраст постановки диагноза 58 лет, средний возраст 44,5 года).
Степень митотической активности в меланомах первичной хороидальной локализации оценивалась по количеству митозов на 300 клеток на 400-кратном увеличении в 10 полях зрения: (1) – менее 10 митозов, (2) – от 10 до 40 митозов, (3) – более 40 митозов. Для дополнительной оценки пролиферативной активности использовался маркер ИГХ-маркер Ki 67.
Образцы опухоли, взятые из боковой колодки глаза после энуклеации, были зафиксированы в 10% забуференном формалине в течение 24-72 часов и залиты в парафиновые блоки. С каждого блока были изготовлены 4-μк срезы, которые монтировали на высоко адгезивные стекла. Иммуногистохимическое исследование проводилось по стандартному протоколу с использованием автостейнера Dako и системы визуализации EnVisison Flex (Dako, Denmark).
В рамках нашего исследования использовались моноклональные антитела к негистонному белку-маркеру клеточной прогрессии (Ki67), белку- регулятору клеточного цикла p53, белку-ингибитору циклин зависимых киназ p16, факторам роста TGFb.
Для подсчѐта уровня экспрессии TGFb использовался метод полуколичественной оценки. Экспрессия Ki67, p53 и p16 оценивалась количественным методом и выражалась в процентах.
Анализ результатов проводился с использованием метода Краскела-Уоллиса и теста Спирмена. Уровень значимости (р) принимался равным 0,1 для каждого из методов.
Экспрессия маркера клеточной пролиферации Ki67, входящего в состав ДНК-полимеразы, выявлялась в 55% случаев. Наличие экспрессии p53 фиксировалось в 69% случаев, но корреляции с количеством митозов в опухолине было выявлено(p=0,547 по тесту Краскела-Уоллиса). Экспрессия p16 выявлена в 71,4% случаях. При этом высокий уровень p16 не был связан с типом УМ или количеством митозов в опухолях. В ходе оценки уровня экспрессии TGFb в УМ нами было отмечено селективное окрашивание ядер клеток преимущественно веретеноклеточного типа в 28,6% наблюдений. В ходе статистического анализа выявлена корреляция между высоким уровнем экспрессии этого маркера и большим количеством митозов в опухоли (по тесту Спирмена p=0,059). Более того, в нашей работе гипотеза о влиянии TGFb на синтез p16INK4a частично подтвердилась на примере УМ: уровень экспрессии ингибитора циклин-зависимых киназ обратно пропорционален уровню TGFb (по тесту Спирмена p=0,102).
В зарубежной литературе представлено немало работ на тему влияния мутаций в гене ТР53 на развитие различных опухолей [11]. Однако, для экспрессии p53 в УМ не было получено однозначных данных, свидетельствующих в пользу наличия связи между высоким уровнем экспрессии и наиболее агрессивным клеточным типом опухоли [5]. Более того часть исследований, подвергает сомнению роль p53 в патогенезе УМ [3]. В нашем исследовании так же не было получено значимых результатов в пользу пропорционального увеличения экспрессии p53 количеству митозов. Таким образом, результаты наши исследований совпадают с основной гипотезой о не характерности наличия мутаций в гене TP53 для патогенеза УМ [2].
Относительно, p16INK4a выдвигались схожие гипотезы, что и для p53. Например, K. Lamperska et al. в своем исследовании установила, что высокая экспрессия p16INK4a в тканях опухоли связана с гистологическим типом УМ, но не коррелирует с глубиной инвазии опухоли [9]. Немаловажно, что в нашем исследовании так же изучалась гипотеза, ранее не исследованная зарубежными авторами, о влиянии высокой экспрессии p16INK4a на степень митотической активности опухоли. Однако, в ходе нашего исследования статистически значимых результатов получено не было. Примечательно, что при анализе экспрессии TGFb были получены статистически значимые данные о корреляции с количеством митозов в УМ. При этом уровень экспрессии TGFb обратно пропорционален уровню p16INK4a. Возможно, что в патогенезе УМ высокий уровень экспрессии p16INK4a связан с нарушением регуляции клеточного цикла на более высоком уровне и подвержен влиянию мутаций в генах рецепторов факторов роста [1]. Данная гипотеза требует дальнейшего исследования с применением генетического анализа мутаций в гене p16 и регулирующих его факторов роста.
Список литературы
1. Abdel-Rahman M.H. Melanoma candidate genes CDKN2A/p16/INK4A, p14ARF, and CDK4 sequencing in patients with uveal melanoma with relative high-risk for hereditary cancer predisposition. / M.H. Abdel-Rahman, R. Pilarski, J.B. Massengill, B.N. Christopher, R. Noss, F. H. Davidorf // Melanoma Res. – 2011. – Т. 21 – № 3 – 175–179с.
2. Bardeesy N. Dual Inactivation of RB and p53 Pathways in RAS-Induced Melanomas / N. Bardeesy, B.C. Bastian, A. Hezel, D. Pinkel, R.A. DePinhyo, L. Chin // Mol. Cell. Biol. – 2001. – Т. 21 – № 6 – 2144–2153с.
3. Chana J.S. c-myc, p53, and Bcl-2 expression and clinical outcome in uveal melanoma. / J.S. Chana, G.D. Wilson, I.A. Cree, R.A. Alexander, N. Myatt, M. Neale, A.J. Foss, J.L. Hungerford // Br. J. Ophthalmol. – 1999. – Т. 83 – № 1 – 110–114с.
4. Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. / Collaborative Ocular Melanoma Study Group. // {…} Cell. Biol. – 2001. – Т. 119 – № 5 – 670–676с.
5. Coupland S.E. The prognostic value of cyclin D1, p53, and MDM2 protein expression in uveal melanoma. / S.E. Coupland, G. Anastassiou, A. Stang, H. Schilling, I. Anagnostopoulos, N. Bornfeld, H. Stein // J. Pathol. – 2000. – Т. 191 – № 2 – 120–126с.
6. Diener-West M. Screening for Metastasis From Choroidal Melanoma: The Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report 23 / M. Diener-West // J. Clin. Oncol. – 2004. – Т. 22 – № 12 – 2438–2444с.
7. Garbe C. Systematic Review of Medical Treatment in Melanoma: Current Status and Future Prospects / C. Garbe, T.K. Eigentler, U. Keilholz, A. Hauschild, J.M. Kirkwood // Oncologist – 2011. – Т. 16 – № 1 – 5–24с.
8. Krvavica A. [ Expression of bcl -2, Ki-67 and p -53 in uveal melanomas ]. / A. Krvavica, J. Talan-Hranilović, M. Belicza // Acta medica Croat. c̆ asopis Hravatske Akad. Med. Znan. – 2008. – Т. 62 – № 3 – 267–271с.
9. Lamperska K. Expression of p16 in sporadic primary uveal melanoma. / K. Lamperska, U. Fuchs, H. M. Hurks, V. V Vit, T. Kivelä, K. Mackiewicz, A. Kaczmarek, J.A. Metzelaar-Blok, P. Summanen, I. Immonen, E. Kwiatkowska, E.R. Barthen, A. Tarkkanen, M. Starzycka, B. Romanowska, J. Heizman, A.H. Zwinderman, J. Stachura, A. Mackiewicz, D. de Wolff-Rouendaal, J. E. Keunen, M. J. Jager // Acta Biochim. Pol. – 2002. – Т. 49
– № 2 – 377–385с.
10. Margo C.E. The Collaborative Ocular Melanoma Study: an overview. / C. E. Margo // Oncologist – 2004. – Т. 11 – № 5 – 304–309с.
11. Nagarkatti-Gude N. Genetics of Primary Intraocular Tumors / N. Nagarkatti-Gude, Y. Wang, M.J. Ali, S.G. Honavar, M.J. Jager, C.-C. Chan // Ocul. Immunol. Inflamm. – 2012. – Т. 20 – № 4 – 244–254с.
12. Singh A.D. Uveal melanoma: epidemiologic aspects. / A.D. Singh, L. Bergman, S. Seregard // Ophthalmol. Clin. North Am. – 2005. – Т. 18 – № 1 – 75–84– viiiс.
