24 апреля 2016г.
По данным отечественных и зарубежных авторов, ведущая роль в возникновении пищевых сальмонеллезов принадлежит мясу и мясным продуктам [5], при этом зараженное сальмонеллами мясо не имеет органолептических признаков несвежести, так как сальмонеллезные бактерии не протеолитичны, а сахаролитичны, что затрудняет ветеринарно-санитарную экспертизу мяса [2]. В настоящее время для выявления возбудителя в объектах эпидемиологического риска используют стандартные и ускоренные (альтернативные) методы анализа [7].
Чувствительность бактериологического анализа высока и составляет около 105 бакт/мл. Однако он трудоемок и требует значительной затраты времени на свое осуществление – от 4 до 7 дней и состоит из четырех этапов [1, 10, 19]. Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в патматериале в небольшом количестве вместе с большим числом других микроорганизмов. Поэтому предварительное обогащение просто необходимо [1, 3]. Затем культуры пересевают в среды для селективного обогащения. Наибольшее применение в работе с сальмонеллами получили среды с тетратионатом натрия (Мюллера-Кауффмана и др.), селенитом F (селенит- цистиновый бульон), бриллиантовым зеленым и среда Раппапорта. Поскольку эти среды не одинаково пригодны для выращивания разных сероваров сальмонелл, то рекомендуется одновременно использовать, по меньшей мере, 2 из них [10]. Использование 0,7% селенита обеспечивает большую селективность против E. сoli и не влияет на восстановление сальмонелл.
Оптимальному росту сальмонелл способствуют пептон, дрожжевой экстракт и лизин [3, 7]. Следует учитывать, что на некоторых средах (например, средах с тетратионатом и среде Раппапорта) отдельные серовары сальмонелл не растут [10]. Сальмонеллы как не ферментирующие лактозу микроорганизмы в подавляющем большинстве случаев дают типичный рост на селективно-дифференциальных средах. Исключение составляют некоторые серологические типы из группы С, в частности S. Typhisuis, на ВСА растущие в виде нежных светло- зеленых или крупных серовато-зеленых колоний [1].
Юдиной А.А. (2009) установлена высокая групповая, родовая и видовая избирательность тест-подложек серии RIDA®COUNT, используемых для определения сальмонелл в естественно и искусственно контаминированных мясе, молоке и продуктах их переработки. В настоящее время доступны альтернативные быстрые микробиологические методы исследования пищевых продуктов. Наибольшей популярностью пользуются готовые к работе системы PetrifilmTM и SimPlateTM, потому что их использование не требует дорогостоящего оборудования [18]. Петрифильмы представляют собой планшет с готовой стандартной сухой культуральной средой с площадью посева около 20 см3, а также гелем и индикатором окраски, который облегчает учет колоний. Выпускают несколько типов петрифильмов, в том числе и те, которые позволяют культивировать бактерии семейства Enterobacteriaceae [21]. Рядом исследователей подтверждена высокая эффективность готовых культуральных подложек при микробиологическом исследовании таких пищевых продуктов как мясо, сырое молоко, сыр, йогурт, рыба [13, 16, 25]. SimPlateTM основывается на мультиферментной технологии, при этом активные ферменты вступают в реакцию с бактериальными контаминантами исследуемого продукта. Принцип действия, также как у PetrifilmTM основан на изменении цвета субстрата под действием микробиологического гидролиза [17].
Интересная модификация метода бактериологического исследования мяса при сальмонеллезе, значительно повышающая его эффективность, испытана В. С. Закардонец. По этому методу нативный материал вносят в пробирку с глюкозным бульоном и выдерживают 3 ч в термостате при 37 + 1 °С. Затем одну каплю бульона засевают в среду Киллиана, через 16—18 ч производят высев на селективно-дифференциальные среды (Плоскирева, висмут-сульфит агар) [1]. Для идентификации рекомендуется брать сразу пять колоний, если на одной чашке менее пяти типичных или не совсем типичных колоний, то для идентификации берут все колонии.
Переносят их на поверхность предварительно подсушенного агара, инкубируют при температуре 37±1°С в течение 24±3 ч. Для дальнейшей идентификации используют только чистые культуры [3]. Для установления принадлежности изолята к сальмонеллам первоначально определяют морфологию, подвижность и тинкториальные свойства его бактериальных клеток, а также их способность окрашиваться по Граму [10]. Вместо окрашивания мазков по Граму можно пользоваться КОН-тестом. В техническом исполнении метод прост: на предметное стекло наносят каплю 3%-ного водного раствора калия гидроксида и смешивают бактериологической петлей часть испытуемой колонии. Через 1—2 сек у грамотрицательных штаммов жидкость в капле становится вязкой и прозрачной, слизь тянется за петлей на 1—3 см и более, в то время как у грамположительных остается равномерно мутной. Метод основан на различии структуры клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий. Воздействие калия гидроксида на грамотрицательные микроорганизмы сопро- вождается нарушением клеточной стенки и выходом из них ДНК (вязкого компонента); у грамположительных видов клеточная стенка прочная. Применение КОН-теста при изучении С. А. Артемьевой (2002) более 3000 культур дало 100%-ное совпадение с окрашиванием по Граму.
Можно использовать короткий пестрый ряд (среды с углеводами — лактозой, глюкозой, сахарозой, маннитом). При необходимости полной типизации сальмонелл проводят посев на расширенный цветной (пестрый) ряд для определения культурально-биохимической активности и исследуют их антигенные свойства. В большой цветной ряд могут быть включены среды Гиссе с различными углеводами: дисахаридами (лактоза, сахароза, трегалоза, мальтоза); пентозами (арабиноза, ксилоза, рамноза); гексозами (глюкоза, галактоза); трисахаридами (раффиноза); полисахаридами (гликоген, крахмал, инулин); спиртами трехатомными (глицерин), пятиатомными (адонит), шестиатомными (дульцит, сорбит). Для изучения ферментативной активности тест- культур на средах пестрого ряда кроме углеводов используют инозит [1].
Для выявления подвижности изоляты сеют уколом в полужидкий (0,2-0,3%) МПА. Неподвижные сальмонеллы растут стержнем по уколу и образуют пласт на поверхности среды, а подвижные по всей толще среды и также образовывают поверхностный пласт. Процесс идентификации изолятов может быть ускорен одновременным определением подвижности и биохимических свойств в полужидких средах с сахарами. При посеве в них уколом подвижные изоляты дают равномерное помутнение среды, а неподвижные растут только по ходу укола.
При определении биохимических свойств изолятов пользуются цветными средами. Тесты проводят в пробирках, микропробирках (метод Сироко) или пастеровских пипетках (метод Фельдмана). Капельные методы дают возможность еще большей степени миниатюризовать анализ. Углеводные бумажные диски позволят обойтись без пестрого ряда сред.
Для ускоренной предварительной идентификации биохимических свойств изолята могут быть использованы разнообразные экспресс-методы, позволяющие получить результаты за 3-12ч [1, 7].
В настоящее время комплексные системы определения биохимической активности сальмонелл типа API постепенно вытесняют более трудоемкие методы [10, 23].
Для серологической идентификации применяют ряд иммунологических тестов (реакция агглютинации (РА), ELISA, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунологический анализ, реакция латекс- агглютинации, реакция преципитации и иммуноблоттитинг) [31].
Первым из предложенных методов иммунологической идентификации стала реакция преципитации с гаптеном, предложенная Штерном в 1941 г. Среди остальных тестов наибольшее распространение получили РА, ставшая основным способом идентификации и типирования выделенных изолятов, и РИФ. Результаты серотипирования служат основой для постановки окончательного диагноза только в том случае, если получены положительные реакции биохимического типирования изолята, во избежание ложного диагноза из-за перекрестной реактогенности О-антигенов сальмонелл и ряда других энтеробактерий [10]. Также необходимо учитывать возможность наличия атипичных биохимических свойств у одного и того же серотипа сальмонелл [15]. Поэтому одновременно с РА культуру засевают на трехсахарный агар Крумвиде—Олькеницкого в модификации Ковальчука или комбинированную среду Олькеницкого. При наличии сальмонелл красно- янтарный цвет среды Крумвиде— Олькеницкого в модификации Ковальчука изменяется следующим образом: столбик становится желтым, цвет скошенной поверхности не изменяется (остается янтарным с красноватым оттенком). По наличию трещин и разрыву столбика агара устанавливают образование газа, по изменению окраски в столбике (почернение) — наличие сероводорода [1].
Для ускорения постановки диагноза предложено выявлять ДНК агента непосредственно в патологическом материале с помощью ДНК-зондирования, ИФА и ПЦР [4, 8, 10, 27]. ДНК-зонды метят радиоизотопами, ферментами или люминисцентными маркерами. Метод ДНК-ДНК-гибридизации характеризуется довольно высокой чувствительностью, достигающей после предварительного культивирования тестируемой пробы в обогатительной среде, уровня 108 бакт/мл.
Метод рРНК-зондирования еще более чувствителен (105 бакт/мл). Кроме того, поскольку молекула рРНК состоит из 1 цепочки, а не 2, как ДНК, отпадает необходимость в проведении денатурации перед гибридизацией [6, 10].
Шароновой Е.И. (2003) на базе ИФА разработан диагностический препарат, приготовленный на основе поливалентных флуоресцирующих Fab-фрагментов иммуноглобулинов. Данный метод позволяет выявлять сальмонеллы групп A, B, C, D, E и их антигены в материалах различного биологического происхождения. Gebreyes W. A. ets. (2005) сравнивали методы: полиморфизм длины рестрикционных фрагментов с использованием ПЦР (AFLP) и гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) (ПЭ). AFLP показал самый высокий результат, хотя пульс-электрофорез хромосомной ДНК, обработанной эндонуклеазами, многие годы считался лучшим методом типирования микроорганизмов [32]. Преимуществом AFLP является использование меньшего количества геномной ДНК и трудозатрат по сравнению с ПЭ, быстрота диагностики, большая разрешающая способность. Из существенных недостатков можно назвать высокую стоимость тест-систем [22].
Поскольку чувствительность этих тестов и ELISA, а также затраты времени и средств на их проведение приблизительно равны, то на практике предпочтение отдается менее трудоемкой ELISA. Однако, ряд авторов рекомендуют использовать ELISA только в качестве скрининг-теста [28].
С помощью ПЦР удается обнаружить крайне малое количество сальмонелл, идентифицировать их на видовом и серогрупповом уровнях и подтвердить принадлежность какого-либо штамма к определенному серовару сальмонелл с отражением информации в генетическом пастопре вакцинных штаммов [12, 26]. Используя базу данных DiversiLab Salmonella kit можно идентифицировать 143 серотипа сальмонелл [29]. Яцышиной С.Б. (2003) разработана ПЦР-тест-система для выявления сальмонелл, обладающая 100 % чувствительностью и специфичностью. С успехом используется ПЦР в реальном времени (a real-time multiplex PCR), позволяющая идентифицировать несколько серотипов сальмонелл [24]. При условии предварительного культивирования посева патологического материала на среде обогащения в течение не менее 1 ч чувствительность теста составляет 160 молекул ДНК/пробу, что недостаточно для отказа от проведения бактериологического исследования [10].
2
Разработаны биодатчики с чувствительностью 1х10 КОЕ/мл, позволяющие обнаружить S. enterica
Typhiumrium в течение 1 часа [30]. Для выделения сальмонелл из пищевых продуктов предложена электромагнитная сепарация с использованием антител и магнитных частиц [14]. При необходимости проводят биологическую пробу на лабораторных животных и устанавливают патогенность [1].
Список литературы
1. Артемьева, С.А. и др. Микробиологический контроль мяса животных, птицы, яиц и продуктов их переработки: Справочник / С.А. Артемьева, Т.Н. Артемьева, А.И. Дмитриев, В.В. Дорутина. – М.: Колос, 2002. – 288 с. 6
2. Ветеринарно-санитарная экспертиза с технологией продуктов животноводства / Под ред. Б.Н. Федотова. – Ленинград: Колос. – 1967. – 544 с. 10
3. ГОСТ 31659-2012 Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella. Москва,
Стандартинформ, 2014. 24 с. 2
4. Доля Е.А. Разработка тест-систем ускоренной индикации и идентификации сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного экологического контроля на основе генных зондов: автореф. дис… канд. биол. наук, Москва, 1997. – 16 с.
5. Загаевский, И.С. Справочник по ветеринарно-санитарной экспертизе животноводческой продукции. – К.: Урожай, 1976. – 160 с. 15
6. Светличкин В.В. Разработка тест-систем и техничеких средств ускоренной оценки безопасности и качества объектов ветеринарно-санитарного контроля: дис…докт. биол. наук, Москва, 2002. – 350 с.
7. Соколов Д.М., Соколов М.С. Ускоренные методы выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах и сырье // Вопросы питания. 2013. № 1 (82). С. 33 – 40.
8. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование возбудителей бактериальных инфекций // Генетика. – 1995. – № 31. – С. 600 – 610.
9. Шаронова Е.И. Усовершенствование лабораторной диагностики сальмонеллезов групп A,B,C,D,E на основе иммунофлуоресцентного анализа: автореферат дис. ... канд. биол. наук, Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. - Пермь, 2003. - 23 c.
10. Шуляк, Б.Ф. Руководство по бактериальным инфекциям собак. Том 2. Грамотрицательные бактерии. – М.: Издательство «ОЛИТА», 2003. – 608 с.
11. Юдина А.А. Усовершенствованные методы индикации санитарно-показательных микроорганизмов в продуктах животного происхождения и на поверхностях технологического оборудования : дисс. …канд. биол. наук, Москва, 2009, 141 с.
12. Яцышина С.Б. Выявление и типирование возбудителей сальмонеллеза молекулярно-генетическими методами: дис…канд. биол. наук, Москва, 2003. – 112 с.
13. Abgrall B., Cleret J.J. Evaluation of Petrifilm™ SM for the enumeration of the aerobic flora of fish. J Food Prot.
1990. Vol. 53. P. 213 – 216.
14. Cerro Adel, Soto S.M., Landeras E., Gonzalez-Hevia M.A., Guijarro J.A., Mendoza M.C. PCR-based procedures in detection and DNA-fingerprinting of Salmonella form samples of animal origin. J. Food Microbiol. 2002. Vol. 19. P. 567 – 575.
15. Edwards R., Matlock B., Heffernan B., Maloy S. Genomic analysis and growth-phase-dependent regulation of the SEF14 fimbriae of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 2705–2715.
16. Ellis P., Meldrum R. Comparison of the compact dry TC and 3M petrifilm ACP dry sheet media methods with the spiral plate method for the examination of randomly selected foods for obtaining aerobic colony counts. J Food Prot. 2002. Vol. 65. P. 423 – 425.
17. Feldsine P.T., Leung S.C., Lienau A.H., Mui L.A., Townsend D.E. (2003) Enumeration of total aerobic microorganisms in foods by SimPlate total plate count-color indicator methods and conventional culture methods: collaborative study. J AOAC Int. 2003. Vol. 86. P. 257 – 274.
18. Ferraty A.R., Tavolaro P., Destro M.T., Landgraf M., Franco B.D.G.M. A comparison of ready-to-use systems for evaluating the micribiological quality of acidic fruit juices using non-pasteurized orange juice as an experimental model. J. International microbiology. 2005. Vol. 8. P. 49 – 53.
19. Fricker C.R. The isolation of Salmonellas and Campylobacters. J AppI Bact. 1987. Vol. 63. P. 99 – 116.
20. Gebreyes W. A., Altier C. and Thakur S. Molecular epidemiology and diversity of Salmonella serovar Typhimurium in pigs using phenotypic and genotypic approaches. J Epidemiol. Infect. 2006. Vol. 134. P. 187–198.
21. Kinneberg K.M., Lindberg K.G. Dry Regydratable Film Metod for Rapid Enumeration of Coliforms in Foods (3MTM PetrifilmTM Rapid Coliform Count Plate): Collaborative Study. J. of AOAC International. 2002. Vol. 85 (1). P. 56 – 71.
22. Lindstedt B.-A., Heir E., Vardund T., Kapperud G. A variation of the amplified-fragment length polymorphism (AFLP) technique using three restriction endonucleases, and of the enzyme combination BgIII-MfeI for AFLP analysis of Salmonella enterica subsp. enterica isolates. FEMS Microbiology Letters. 2000. Vol. 189. P. 19 – 24.
23. Nekohorosheva A.G., Skala P.Z., Polikarpova S.V., Vinokurov A.E., Skazhenik V.I. The use of improved commercial micro-LA-tests for the identification of different groups of microorganisms in clinical microbiology. Klin Lab Diagn. 2000. Vol. 3. P. 51 – 54.
24. O’Regan E., McCabe E., Burgess C., McGuinness S., Barry T., Duffy G., Whyte P., Fanning S. 2008.
Development of a real-time multiplex PCR assay for the detection of multiple Salmonella serotypes in chicken samples. BMC Microbiol. 2008. Vol. 21(8). P. 156.
25. Park Y.H., Seo K.S., Ahn J.S., Yoo H.S., Kim S.P. Evaluation of the Petrifilm plate method for the enumeration of aerobic microorganisms and coliforms in retailed meat samples J Food Prot. 2001. Vol. 64. P. 1841 – 1843.
26. Patel J.R., Bhagwatb A.A., Sanglaya G.C., Solomon M.B. Rapid detection of Salmonella from hydrodynamic pressure-treated poultry using molecular beacon real-time PCR Food Microbiology. 2006. Vol. 23. P. 39–46.
27. Peter Feng. Rapid Methods for Detecting Foodborne. Bacteriological Analytical Manual. Appendix 1. January
2001 P.1 – 14.
28. Radojicic Marina et al. Study of the presence of specific Salmonella Enteritidis antibodies in chicken egg yolks by competitive cELISA method. Acta Veterinaria (Beograd). 2011. Vol. 61, No. 2-3. P. 205 – 214.
29. Reece K., Frye S., Dutch W., Lising M. Et al. Serotiping of Salmonella Isolates Using the DiversiLab System and Associated Salmonella Database. American Society of Microbiology June 5-9, 2009.
30. Shuqing Zhang Development of a biosensor for the rapid detection of Salmonella Tythimurium in milk. A Dissertation Submitted to the Graduate Faculty of Auburn University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy Auburn, Alabama. December 16, 2005 р. 88.
31. Swaminathan B. Rapid detection of food borne pathogenic bacteria. Ann Rev Micr. 1994. Vol. 48. P. 401 – 426.
32. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol. 1995. Vol. 33. P. 2233 – 2239.
