31 августа 2017г.
Ключевые слова: гепатоциты, кора надпочечников, кислая и щелочная фосфатаза, стимулятор роста растений.
Введение. Загрязнение окружающей среды биогенными факторами приобретает все более широкие масштабы. Ежегодно список веществ, способных изменять интенсивность физиологических процессов растений непрерывно увеличивается, расширяются области применения стимуляторов роста растений, совершенствуются приемы обработки растений. Под действием этих факторов возникают серьезные физиологические изменения в организмах, приводящие нередко к различным патологическим состояниям.
Целью настоящего исследования явилось изучение гистохимических показателей кислой и щелочной фосфатаз коры надпочечников, печени экспериментальных животных на фоне длительного перорального введения стимулятора роста растений (альфа-(2-хлорэтокси) поли [2 хлорэтилфосфорилоксиэтиленоксил]-омега-(2 хлорэтокси-2-хлорэтилфосфо нада) в различных дозах. Стимулятор роста растений синтезирован в Чувашском государственном университете имени И.Н. Ульянова в 1990 г. профессором В.В. Кормачевым и его учениками с присвоением государственного регистрационного номера 9998590 от 18.10.90 г. Авторское свидетельство №1792610, опубликовано в Бюллетене изобретений в 1993 г. №5.
Актуальность. Ухудшения экологической обстановки, связанные с интенсификацией промышленного производства, химизацией сельского хозяйства, увеличивает вероятность острых и хронических отравлений организма человека.
Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение гистохимических показателей кислой и щелочной фосфатаз коры надпочечников и печени экспериментальных животных на фоне длительного перорального введения стимулятора роста растений (альфа-(2-хлорэтокси) поли [2 хлорэтилфосфорилоксиэтиленоксил]-омега-(2 хлорэтокси-2-хлорэтилфосфонада) в различных дозах.
Материалы и методы исследования. В качестве экспериментальных животных были использованы самцы морских свинок массой 400-600г. Основные экспериментальные опыты проводились в 4 сериях: первая серия – интактная (контрольная) – 20 животных, для определения физиологического исходного уровня исследуемых веществ. Следующие три серии – ежедневно перорально вводился стимулятор роста растений в течение 3 месяцев из расчета 2,0 мг/ кг (20 животных), 20,0 мг/кг(20 животных), 100,0 мг/кг (20 животных) массы тела животного.
Все животные были забиты до кормления под глубоким масочным эфирным наркозом. Печень и надпочечник замораживался в камере микротома (МК-25) при температуре -21°С с последующим изготовлением срезов толщиной 15 мкм, которые подвергались дальнейшим гистохимическим методам исследования [1].
Методы выявления кислой и щелочной фосфатазы.
Уровень активности щелочной фосфатазы определяется с использованием фосфат нафтола AS-BI, прочного синего ВВ и трис-HCI-буфера в прописи Burstone [2]. Последующее определение активности фермента проводилась вычислением логарифма оптической плотности по методике [2]. Активность кислой фосфатазы определялась с использованием фосфат нафтола AS-BI, прочного синего ВВ и 0,1М ацетатного буфера в прописи Burston [1].
Методы статистической обработки
Результаты обрабатывали статистически, используя t критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Фосфатазами называют ферменты, которые катализируют отщепление фосфорной кислоты от ее органических соединений. В зависимости от оптимума рН различают несколько групп фосфомоноэстераз. Наиболее клинико-диагностическое значение имеет определение фосфомоноэстеразы 1 или щелочной фосфатазы, оптимум рН 8,6 – 10,1, а также фосфомоноэстеразы 2 или кислой фосфатазы, оптимум рН 5,0 – 5,5 [1] . Щелочная фосфатаза относится к большой группе белков – эктоферментов, которые «заякорены» на внешней поверхности мембран клеток с помощью гликозилфосфатидилинозитола. Связанный с мембраной фермент является тетрамером, а растворимый, циркулирующий в крови димером. Фосфолипазы С и Д плазмы способны отщеплять фермент от мембраны, переводя его в растворимую форму. В крови присутствуют и высокомолекулярные фрагменты мембран клеток печени вместе с прикрепленной к ним ЩФ [1; 2; 3; 4; 5].
Активность щелочной фосфатазы в секрете подъязычной и подчелюстной железы ниже по сравнению с активностью в секретах левой и правой околоушных желез, что вполне закономерно, т.к. левая и правая околоушные железы осдержат большое количество серозных клеток, синтезируют железистую слюну с высоким содержанием белков и высокой аминолитической активностью. Секрет же подъязычной и подчелюстной слюнных железбогат органическими веществами, содержит много муцина [6].
Кислая фосфатаза локализуется преимущественно в лизосомах, в эндоплазматическом ретикулуме и, возможно, в гиалоплазме. Активность кислой фосфатазы особенно высока в селезенке, почках, печени, тонком кишечнике и надпочечниках [ 2; 4].
Результаты проведенных исследований приведены в таблице 1.
Активность кислой и щелочной фосфатаз в структурах надпочечников (в усл. ед.)
Таблица 1
|
|
Струк туры
|
Серии опытов
|
|
Контроль
(1-ая) серия, М±m
|
2-ая cерия,
М±m
|
Р
|
3-я серия,
М±m
|
Р1
|
4-ая
серия, М±m
|
Р2
|
|
Кислая фосфат аза
|
Клубочко
вый
|
0,60±0,01
|
0,56±0,01
|
Р<0,001
|
0,48±0,01
|
Р<0,001
Р1<0,001
|
0,41±0,01
|
Р<0,001
Р1<0,001 Р2<0,001
|
|
Пучко
вый
|
0,34±0,01
|
0,30±0,01
|
Р<0,001
|
0,25±0,01
|
Р<0,001
Р1<0,001
|
0,19±0,01
|
Р<0,001
Р1<0,001
|
|
Р2<0,001
|
|
Сетча
|
0,27±0,01
|
0,24±0,01
|
Р<0,001
|
0,21±0,01
|
Р<0,001
|
0,16±0,01
|
Р<0,001
|
|
тый
|
Р1<0,001
|
Р1<0,001
|
|
Р2<0,001
|
|
Щелоч
|
Клубочков
|
0,21±0,01
|
0,18±0,01
|
Р<0,001
|
0,14±0,01
|
Р<0,001
|
0,12±0,01
|
Р<0,001
|
|
ый
|
Р1<0,001
|
Р1<0,001
|
|
Р2<0,001
|
|
ная
|
Пучко
|
0,23±0,01
|
0,19±0,01
|
Р<0,001
|
0,17±0,01
|
Р<0,001
|
0,13±0,01
|
Р<0,001
|
|
фосфат
|
вый
|
Р1<0,001
|
|
аза
|
Р1<0,001
|
Р2<0,001
|
|
Сетча
|
0,16±0,01
|
0,14±0,01
|
Р<0,001
|
0,12±0,01
|
Р<0,001
|
0,08±0,01
|
Р<0,001
|
|
тый
|
Р1<0,001
|
|
Р1<0,001
|
Р2<0,001
|
Примечание: Р – по отношению к интактной серии; Р1 – по отношению к 2-й серии; Р2 – по отношению к 3-й серии.
Степень активности щелочной фосфотазы в корковом веществе надпочечников в различных условиях значительно колеблется,более выражено в клубочковой и пучковой зонах, в то время как в сетчатой зоне степень ее активности остается на низком уровне
При гистохимическом исследовании активности кислой фосфатазы в клубочковом слое коры надпочечников выявлено, что уровень этого фермента в 4-ой серии составила 0,41±0,01 усл.ед., 3-ей серии 0,48±0,01 усл.ед., 2-ой серии 0,56±0,01 усл. ед., 1-ой серии 0,60±0,01 усл.ед.. В пучковом слое коры надпочечников активность этого фермента в 4-ой серии составила 0,19±0,01 усл.ед., 3-ей серии 0,25±0,01 усл.ед., 2-ой серии 0,30±0,01 усл.ед., 1-ой серии 0,34±0,01 усл.ед
В сетчатом слое коры надпочечников уровень содержания кислой фосфатазы составила в 4-ой серии 0,16±0,01 усл.ед., 3-ей серии 0,21±0,01 усл.ед., 2-ой серии 0,24±0,01 усл.ед., 1-ой серии 0,27±0,01 усл.ед..
Гистохимическое исследование активности щелочной фосфатазы в клубочковом слое коры надпочечников составило в 4-ой серии 0,12±0,01 усл.ед., 3-ей серии 0,14±0,01 усл.ед., 2-ой серии 0,18±0,01 усл.ед., 1-ой серии 0,21±0,01 усл.ед.. В пучковом слое коры надпочечников уровень содержания щелочной фосфатазы составила в 4-ой серии 0,13±0,01 усл.ед., 3-ей серии 0,17±0,01 усл.ед., 2-ой серии 0,19±0,01 усл.ед., 1-ой серии 0,23±0,01 усл.ед.. В сетчатом слое коры надпочечников активность этого фермента составила в 4-ой серии 0,08±0,01 усл.ед., 3-ей серии 0,12±0,01 усл.ед., 2-ой серии 0,14±0,01 усл.ед., 1-ой серии 0,16±0,01 усл.ед..
Степень активности щелочной фосфотазы в корковом веществе надпочечников в различных условиях значительно колеблется,более выражено в клубочковой и пучковой зонах, в то время как в сетчатой зоне степень ее активности остается на низком уровне [7], что согласуется с нашими данными методами исследования.
Активность кислой и щелочной фосфатаз в структурах печени (в усл. ед.)
Таблица 2
|
|
Серии опытов
|
|
Контроль
ные (интактные) животные
(1-ая) серия, М±m
|
2-ая cерия М±m
|
Р
|
3-я серия, М±m
|
Р1
|
4-ая серия, М±m
|
Р2
|
|
Кислая
|
0,23±0,002
|
0,20±0,002
|
Р<0,001
|
0,16±0,002
|
Р<0,001
|
0,14±0,002
|
Р<0,001
|
|
фосфатаза
|
Р1<0,001
|
Р1<0,001
|
|
Р2<0,001
|
|
Щелочная
|
0,29±0,002
|
0,26±0,002
|
Р<0,001
|
0,18±0,002
|
Р<0,001
|
0,14±0,002
|
Р<0,001
|
|
фосфатаза
|
Р1<0,001
|
Р1<0,001
|
|
Р2<0,001
|
Примечание: Р – по отношению к интактной серии; Р1 – по отношению к 2-й серии; Р2 – по отношению к 3-й серии;
Активность кислой и щелочной фосфатаз гепатоцитов 1-й серии интактных животных и у животных после перорального введения стимулятора роста растений 2-й (2 мг/кг), 3-й (20 мг/кг), 4-й (100 мг/кг) серии (усл. ед.)
Как видно из таблицы 2, активность кислой фосфатазы в гепатоцитах 1-й серии составила 0,23±0,002 усл.ед., во 2-й , 3-й и 4-й серии отмечаем снижение активности кислой фосфатазы в гепатоцитах (2-й 0,20± 0,002 усл.ед., 3-й 0,16 ±0,002 усл.ед. и 4-й 0,14± 0,002 усл.ед.).
Количественный гистохимический анализ щелочной фосфатазы в гепатоцитах морских свинок 4-й составил 0,14±0,002 усл.ед., в интактной серии – 0,29± 0,002 усл.ед., 2-й- 0,26± 0,002 усл.ед., и 3-й- 0,18±0,002 усл.ед.
У трехмесячных крольчат в тканях печени в условиях введения в организм 60% этанола уровень фермента ЩФ и КФ уменьшается в связи с повышением чувствительности у физиологически зрелых животных к эталону [5,6]. Данные результаты полностью согласуются со сведениями об угнетении в печени ферментов кислой и щелочной фосфатаз при этаноловой интоксикации.
Гистохимическое исследование активности ферментов кислой и щелочной фосфатаз выявило, что активность этих ферментов в гепатоцитах и в коре надпочечников снижается по мере увеличения дозы вводимого стимулятора роста растений.
Выводы. Пероральное введение симулятора роста растений в различных дозах (2 мг/кг, 20 мг/кг, 100 мг/кг) подопытным животным в течение трех месяцев сопровождается снижением активности кислой и щелочной фосфатаз в гепатоцитах и коры надпочечников по мере увеличения дозы вводимого вещества.
Список литературы
1. Лойда З. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. /З.Лойда, Р.Госсрау, Т.Шиблер/ -М., 1982– 270с.
2. Тимин О.А., Клементьева Т.К., Серебров В.Ю. , Жаворонок Т.В., Кузьменко Д.И., Удинцев С.Н. Биохимические методы исследования в клинико-диагностических лабораториях: практическое пособие. – Томск: STT, 2002. – 244 с.
3. Иванов Л. Н., Колотилова М. Л., Ялукова С. Л., Юсов А. А., Алексеева Н. В. Общая и клиническая патофизиология печени и желчевыводящих путей. Учебное пособие. Чув. ГУ, Чебоксары, 2012. 111с.
4. Юсов А.А., Кириллов Н.А., Яковлева Л.М., Селиванова С.В. Неспецифическая реактивность организма экспериментальных животных в условиях перорального воздействия стимулятора роста растений..//Материалы Межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 40-летию кафедры патофизиологии. «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» Чебоксары, 26 сентября 2014 г. С.117-123.
5. Игнатьев Н.Г., Иванова А.Н. Активность фосфатаз и амилазы в тканях печени у крольчат при введении этанола. Ж. Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана. 2015. Выпуск №1, Том 221. С.82-85
6. Чепрасова А.А., Пашков А.Н., Карташова Н.М., Патрицкая В.Ю., Парфенова Н.В. Активность щелочной фосфатазы в секретах больших слюнных желез человека в постнатальном онтогенезе. Международный научно-исследовательский журнал. 2017. Выпуск №3(45) Часть3. С. 33-35.
